背景：　　中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）是2102年发现的可引起人类重症呼吸道感染的一种新型冠状病毒，目前感染范围已波及27个国家，主要集中在中东地区和韩国，其致死率也超过SARS-CoV，达到了36％左右。然而目前并没有有效的可用于MERS-CoV感染治疗和预防的措施。　　MERS-CoV是一类有包膜单股正链 RNA病毒，属于冠状病毒属 C亚群，基因组全长约30kb，主要包括纤突（spike，S）蛋白，包膜（envelope，E）蛋白，膜（membrane，M）蛋白和核衣壳（nuclecapsid，N）蛋白四种结构蛋白。其中S蛋白作为MERS-CoV重要的囊膜蛋白，以三聚体的形式存在病毒膜表面，在病毒感染宿主细胞过程中发挥着重要作用，是病毒疫苗及相关抗体治疗药物研究设计的重要位点;主要包括S1和S2两个重要的亚单位；S1亚单位通过其受体结合区（receptor binding domain, RBD）介导病毒与宿主细胞表面DPP4受体识别，S2亚单位通过其构象改变后形成的六股螺旋束结构介导膜融合过程的发生。 N蛋白主要参与病毒的遗传物质的复制过程，常作为MERS-CoV血清学诊断的主要结构蛋白。M蛋白和E蛋白在病毒的形态发生和装配过程中发挥着重要作用。　　S1亚基的RBD区是MERS-CoV单抗及疫苗研究设计的重要位点，目前，不同的研究团队筛选到了针对此病毒的中和单抗，其作用表位几乎都位于S1亚基的RBD区域。事实上，S蛋白作为一种天然空间构象结构，RBD区域外的其他结构域在病毒感染过程中一定也起着某种重要的作用，本研究中MERS-CoVS1亚基的NTD（N-terminal domain of S1 subunit）区域以及S2亚基区域中和单抗的发现就证实了这个观点，提示不同中和机制在MERS-CoV感染过程中存在的可能性。除此之外，不同种类的MERS-CoV疫苗也逐渐被研制出来，但由于疫苗制备、保存及免疫方式等的不同，其批内或批间免疫效果存在一定的差异性，而建立有效的疫苗定量检测平台将能顺利解决这个问题，本研究中，基于RBD蛋白单抗ELISA双抗体夹心法的建立为此检测平台的建立提供了可能。　　研究目的：　　通过免疫小鼠制备大批单克隆抗体，从中筛选出特异针对MERS-CoV核衣壳（N）蛋白及棘突（S）蛋白的单克隆抗体；对筛选出的抗S不同区域的单抗进行生物学特性分析，可为MERS-CoV的血清学诊断和疫苗研发提供技术支持，同时为病毒感染入侵与中和机制研究提供参考。　　研究方法及结果：　　一、 MERS-CoV S与NP蛋白小鼠单抗的制备　　本实验通过小鼠免疫、杂交瘤细胞融合技术及 ELISA检测技术的应用筛选能稳定分泌抗MERS-CoV S和N蛋白的单抗细胞株，接着将S单抗统一定量为1μg/ml,验证其中和MERS-CoV假病毒和结合MERS-CoV不同区段重组蛋白rS1、rS2、rRBD和rNTD ELISA能力。结果显示：20株单抗针对RBD区域，其中6株单抗中和假病毒能力达到90%以上，4株达到50%~90%之间；5株单抗针对NTD区域，其中3株单抗中和假病毒能力达到50%~90%之间；3株单抗针对S2区域，其中1株单抗中和假病毒能力达到50%~90%之间；3株针对S1亚基的RBD、NTD外区域，中和假病毒能力均小于50%；除此之外，3株单抗具有交叉结合不同重组蛋白现象，其中2株单抗中和假病毒能力达到50%~90%之间。　　二、基于RBD单抗ELISA双抗体夹心法建立　　疫苗是预防病毒感染的重要手段，而有效的疫苗质量监测评价方法的建立将对疫苗研发提供重要技术支持。应用合作科室自主研发的荧光免疫层析检测平台，对34株单抗进行荧光标记，与未标记的单抗相互配对检测MERS-CoV rS蛋白，其中M1C12F4与M4E8C5单抗配对组合显示出了最高的灵敏度；接着将单抗M1C12F4与M4E8C5用辣根过氧化物酶（HRP）标记后与未标记的M4E8C5与M1C12F4进行配对检测不同浓度MERS-CoV rS蛋白，同时对实验室现有的灭活MERS-CoV病毒、HKU1-OC43病毒、MHV病毒、SARS-CoV假病毒和HKU1-S1蛋白进行了初步检测；最后对配对单抗与 rRBD蛋白结合亲和力和 MERS-CoV中和能力进行了生物学特性分析。实验结果显示，单抗组合M1C12F4作为捕获抗体、M4E8C5作为标记抗体配对组合表现出极高的MERS-CoV rS检测灵敏度和特异度，其最低检测浓度达到0.06μg/ml；此配对抗体对其他冠状病毒和相应的蛋白的初步检测结果均显示阴性；同时这两株单抗均能有效的与MERS-CoV rRBD蛋白结合及中和MERS-CoV病毒感染，具有很好的应用前景。　　三、MERS-CoV NTD、S2单抗生物学特性分析　　为了深入了解作用于NTD和S2区域单抗的中和作用特点，对筛选到的具有MERS-CoV假病毒中和能力的3株NTD单抗和1株S2单抗分别验证了其在不同浓度下与rNTD、rS2的结合亲和力以及中和MERS-CoV假病毒和活毒感染的能力。同时应用Western blot技术验证了NTD单抗与变性重组蛋白 rNTD的结合能力，接着对可疑线性表位 NTD单抗验证了其18aa肽ELISA结合特点。实验结果显示NTD、S2中和单抗均可有效的阻断MERS-CoV感染宿主细胞，但其中和能力有所差别，相对于强中和能力RBD单抗稍差，尤其是S2单抗只呈现出微弱的MERS-CoV中和能力；3株NTD中和单抗表位初步分析结果显示其与变性rNTD蛋白结合能力不同，推测其结合表位有所差别。　　结论：　　本研究筛选到34株针对MERS-CoV S蛋白和32株针对N蛋白的单抗，其中针对S蛋白单抗具有中和活性的抗原结合表位位于MERS-CoV的不同区域，包括S1亚基的RBD区域、NTD区域和 S2亚基区域；三株 NTD中和单抗结合抗原表位不同的初步分析结果提示MERS-CoV多种中和作用机制的存在的可能。同时成功筛选出一对基于MERS-CoV RBD单抗的配对组合，显示了个位数ng级别的S蛋白检测灵敏性和特异性，为MERS-CoV血清学诊断及疫苗质量控制提供技术支持。