前言：　　炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）为一类反复发作的胃肠道慢性非特异性炎症。发病率逐年增高，可见于任何年龄，但20岁以下患儿占IBD总数的25％-30％。IBD是儿童和青少年时期重要的慢性胃肠道疾病，具有慢性、反复发作的疾病特点，严重影响了患者的生长发育和生活质量。迄今为止，IBD的病因和发病机制仍不明确，国内外大多学者认为是由大量肠道细菌诱发的过度肠黏膜免疫反应，在具有遗传易感性的人群中导致肠黏膜损伤。近年来，人们对IBD发病及治疗有了新的认识，认为不论是肠道的原发性病变，还是继发性损害，均会造成肠黏膜屏障结构和功能的损伤。因此研究肠黏膜屏障的结构和功能，有效维持和修复肠黏膜屏障，可望成为治疗IBD的新策略。　　肠黏膜屏障是指肠道能够防止肠腔内的有害物质如病原体和毒素通过肠黏膜进入人体内其他组织、器官和血液循环的结构和功能的总和，它在防御外来抗原物质对机体的侵袭，保持机体内环境相对稳定，维持机体的正常生命活动等方面有重要的作用。肠黏膜屏障的组成可归纳为三部分:①机械屏障即肠上皮和肠黏液;②生态屏障即正常肠道菌群;③免疫屏障即分泌性IgA、黏膜下和黏膜内各种免疫细胞。肠上皮屏障的完整及肠黏液成分的稳定在维持整个肠黏膜屏障功能及肠道稳态中起着至关重要的作用。肠上皮屏障主要由完整的肠上皮细胞和细胞间的紧密连接等组成，能够维持正常的肠黏膜通透性。本研究将通过体外培养Caco-2细胞单层，模拟人肠上皮细胞屏障。　　Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是天然免疫系统中的一种细胞跨膜糖蛋白，通过对病原微生物的识别触发信号转导通路从而激活免疫系统，是一种识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的模式识别受体。TLRs可表达于肠上皮细胞中，并介导微生物与绌胞之间的相互作用，与黏膜耐受和保护有密切关系，对维护正常的肠黏膜屏障必不可少。TLRs信号途径可以引起紧密连接蛋白ZO-1向细胞顶部紧密连接处转移，从而增强肠上皮屏障的完整性。在小鼠结肠炎模型中，TLR2配体PCSK可以保护紧密连接相关的肠屏障完整性，降低肠通透性;而TLR2基因缺失鼠则修复延迟或无修复反应。　　肠三叶因子(intestinal trefoil factor，TFF3)是一种主要由杯状细胞分泌的短肽蛋白，是肠黏液的主要组成成分，在肠道的损伤愈合和修复方而起着重要作用。TFF3基因缺失小鼠对化学性、放射性、缺氧性肠道损伤极为敏感并难以恢复，将外源性的重组TFF3经口灌胃给TFF3基因缺失的结肠炎小鼠，可加快其黏膜修复。　　TFF3是目前发现与肠损伤防御和修复关系最为密切的生长因子类多肽物质;TLR2不但在肠道先天免疫中占据重要地位，而且在肠上皮屏障保护中扮演着重要角色。那么，TLR2和TFF3对肠上皮细胞屏障保护作用的具体机制如何？它们之间又是否存在某种关联？如能揭示这些问题不仅补充了肠道免疫屏障与肠道机械屏障相互作用的具体机制，更为进一步以TLR2或TFF3为靶点，研制新型的维持和修复肠黏膜屏障的有效药物奠定了理论与实验基础。　　实验材料及方法：　　一、细胞培养　　Caco-2细胞株，人克隆结直肠腺癌细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，结构和功能近似于分化的人肠道上皮细胞，国际上广泛应用于体外模拟人肠道上皮细胞骨架、连接结构和通透性研究，也用于信号传导通路及细胞因子等研究。应用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％CO2条件下进行培养，每5d按1∶2的比例传代。细胞于培养瓶中培养，待细胞生长融合至80-85％左右收集，分别接种于6孔板和Transwell24孔板，培养21天形成细胞单层，按实验分组给予慢病毒转染、试剂干预，进行后续实验。每种实验均选取至少三组非同代细胞进行。　　二、实验分组　　细胞按是否应用慢病毒转染分为4组:　　Caco-2组:正常Caco-2细胞单层。　　siTLR2组:TLR基因沉默Caco-2细胞单层，正常Caco-2细胞单层与siTLR2慢病毒作用96小时。　　TFF3组:TFF3基因过表达Caco-2细胞单层，正常Caco-2细胞单层与TFF3过表达质粒慢病毒作用96小时　　TLR2组:TLR2基因过表达Caco-2细胞单层，正常Caco-2细胞单层与TLR2过表达质粒慢病毒作用96小时　　每组细胞再按不同干预条件分为3组:　　正常对照组:未转染或转染后Caco-2细胞单层不做处理。　　炎症组:未转染或转染后96小时Caco-2细胞单层，用IL-1β10 ng/ml处理48小时。　　抑制剂组:炎症组细胞IL-1β处理前1小时，用PI3K/Akt通路抑制剂LY29400225μM处理1h。　　各组细胞单层均于实验第21天收集，检测。　　三、实验方法及检测指标　　（一）体外正常及炎症性肠上皮细胞屏障模型的建立　　应用Caco-2细胞株在Transwell24孔板上培养21天建立正常肠上皮细胞单层屏障，再给予IL-1β处理，形成炎症性肠上皮细胞屏障模型，并应用跨膜电阻(TEER)检测肠上皮细胞屏障的形成情况。　　（二）TLR2和TFF3对肠上皮细胞屏障通透性的作用　　1、跨膜电阻(TEER)检测反应肠上皮细胞屏障的通透性及完整性，用Millicell-ERS跨膜电阻仪测定细胞的跨膜电阻值，分别于IL-1β处理不同时间检测TEER值及TLR2和TFF3蛋白含量。　　2、检测正常对照组和炎症组中，未转染细胞、TLR2沉默细胞、TLR2或TFF3过表达细胞TEER值。　　（三）TLR2和TFF3对肠上皮细胞屏障紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的影响　　通过Western blot检测正常肠上皮细胞屏障和炎症性肠上皮细胞屏障中，未转染细胞、TLR2沉默细胞、TLR2或TFF3过表达细胞紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1水平。　　(四)TLR2和TFF3对肠上皮细胞屏障炎性细胞因子TNF-α，IL-6，IL-8的影响　　应用Elisa法检测正常肠上皮细胞屏障和炎症性肠上皮细胞屏障中，未转染细胞、TLR2沉默细胞、TLR2或TFF3过表达细胞炎性细胞因子TNF-α，IL-6，IL-8的释放。　　（五）TLR2与TFF3之间的关系　　通过RT-PCR和Western blot分别检测正常肠上皮细胞屏障和炎症性肠上皮细胞屏障中，未转染细胞、TLR2沉默细胞、TLR2或TFF3过表达细胞TLR2和TFF3mRNA值和蛋白表达情况。　　（六）TLR2和TFF3与PI3K/Akt通路之间的关系　　给予炎症组细胞PI3K/Akt通路抑制剂后，分别检测未转染细胞、TLR2沉默细胞、TLR2或TFF3过表达细胞TLR2和TFF3 mRNA值和蛋白表达情况，Akt和p-Akt蛋白水平，紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表达，炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8释放，与正常对照组及炎症组细胞比较，研究TLR2和TFF3之间的相互作用以及TLR2和TFF3对紧密连接蛋白、炎性细胞因子的影响是否由PI3K/Akt通路介导。　　四、统计学分析　　所有实验均重复3次以上，结果用Mean±SD表示，统计由SPSS13.0软件完成。采用One-Way ANOVA法比较总体和组间差异，P＜0.05认为有显著差异。　　结果：　　一、利用Caco-2细胞建立体外肠上皮细胞屏障　　Caco-2细胞随着培养时间的延长，逐渐融合成片，成单层生长，光镜下呈多角形、不规则多边形或鹅卵石样，相邻细胞连接紧密，可见致密的反光带。至21天左右，细胞形成紧密单层，紧密连接形成，建立了一个极性的上皮细胞层。在极性的Caco-2细胞检测TEER用于评价单层完整性的形成，认为TEER值＞450Ω/cm2反应功能性的极性形成。Caco-2细胞单层从培养第5天开始每2天检测TEER值至第21天，TEER从第5天至第15天逐渐增加，在第15天已经达到600Ω/cm2，并到达平台期保持至第21天，TEER稳定在600-700Ω/cm2。体外肠上皮细胞屏障建立，可用于后续实验。　　二、IL-1β对Caco-2细胞单层屏障通透性及TLR2和TFF3蛋白表达的影响　　炎症组Caco-2细胞单层从培养第5天开始每2天用10ng/ml IL-1β处理2h，之后检测TEER值，至第21天。结果显示，炎症组细胞TEER值均低于正常组细胞，并且直至第21天仍＜500Ω/cm2，可见IL-1β对Caco-2细胞单层通透性存在稳定降低作用。Caco-2细胞单层用IL-1β处理不同时间(0，12，24，48，72h)，结果显示时间依赖性的TEER逐渐降低，在48h达到最大值，然后在72h轻度增加。因此，选择IL-1β刺激Caco-2细胞48h制造炎症性肠上皮细胞屏障模型用于后续实验。　　通过WB检测TLR2和TFF3蛋白表达水平，TLR2和TFF3蛋白水平在12h轻度增加，然后逐渐降低直至48h，在72h又有轻度增加，这与TEER对IL-1β处理的改变模式相似。蛋白定量分析显示，在IL-1β作用48h后TLR2和TFF3水平分别下降约50％和40％，均有统计学意义。可见TLR2和TFF3与肠上皮细胞屏障通透性具有某种联系。　　三、TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障TEER的保护作用　　研究TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障TEER的保护作用。结果显示，TLR2基因沉默能够显著地降低TEER，无论在正常细胞组(P＜0.01)还是炎症细胞组(P＜0.05)。而TLR2和TFF3的过表达增加TEER，特别是在炎症组细胞(P＜0.01)。可见TLR2和TFF3能够防止IL-1β诱导的肠上皮细胞屏障通透性增加。　　四、TLR2和TFF3对肠上皮细胞屏障紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1蛋白表达的影响　　总体观察，无论在正常还是炎症性肠上皮细胞屏障，TLR2基因的沉默能下调Occludin，Claudin-1和ZO-1蛋白表达，而TLR2或TFF3基因过表达作用则相反。　　五、TLR2和TFF3对肠上皮细胞屏障炎性细胞因子TNF-α，IL-6，IL-8表达的影响　　IL-1β增加炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的释放，这种作用被TLR2的沉默显著增加(p＜0.05)。相反，TLR2和TFF3的过表达显著抑制IL-1β诱导的TNF-α，IL-6(p＜0.01)和IL-8上调。说明TLR2和TFF3能够通过降低炎症性肠上皮细胞屏障的炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的释放保护肠上皮细胞屏障。　　六、TLR2对TFF3的调控作用及与PI3K/Akt通路活化的关系　　TLR2基因的沉默显著地降低了正常组，炎症组和PI3K/Akt通路抑制剂组细胞TFF3 mRNA(P＜0.05)和蛋白表达(P＜0.05); TLR2基因的过表达在正常对照组，炎症组(P＜0.01)和抑制剂组则明显增加了TFF3 mRNA和蛋白表达。而TFF3基因的过表达对于TLR2 mRNA和蛋白表达均无显著影响。可见，TLR2对于TFF3具有调节作用，且此作用不受PI3K/Akt通路抑制的影响，而TFF3的过表达则不能上调TLR2。　　七、TLR2与TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障的保护作用与PI3K/Akt通路的关系　　为了进一步研究TLR2，TFF3和PI3K/Akt通路的关系，我们在炎症组细胞给予PI3K/Akt通路抑制剂，并分别检测正常对照组，炎症组和抑制剂组Akt活化情况即磷酸化-Akt的水平。结果显示，无论是否给予IL-1β刺激，TLR2沉默下调p-Akt水平(p＜0.01)，而TLR2或TFF3过表达增加p-Akt水平，并且不影响Akt总水平，这种作用被抑制剂的预处理消除。　　TLR2和TFF3能够上调IL-1β导致的Caco-2细胞单层TEER下降，但给予PI3K抑制剂预处理消除了这种作用，提示TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障通透性的保护作用依赖于PI3K/Akt通路的激活。　　TLR2的沉默下调Occludin，Claudin-1和ZO-1，而TLR2或TFF3过表达则上调Occludin，Claudin-1和ZO-1，但抑制剂预处理能减弱这种作用。TLR2和TFF3的过表达显著抑制IL-1β诱导的TNF-α，IL-6和IL-8的上调，并且这种作用被抑制剂的预处理消除。提示TLR2和TFF3对紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1和炎性细胞因子TNF-α，IL-6，IL-8的调控作用有PI3K/Akt通路的参与。　　结论：　　1、培养2-3w的Caco-2细胞具有单层屏障结构，可用于体外模拟人肠道上皮细胞屏障的相关实验。　　2、应用IL-1β刺激Caco-2细胞单层可引起细胞炎症，体外模拟人炎症性肠道上皮细胞屏障，用于相关实验。　　3、应用IL-1β造成Caco-2细胞单层炎症导致TLR2与TFF3蛋白表达降低，并与TEER降低即屏障功能下降相一致。　　4、TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞单层屏障通透性有保护作用。　　5、TLR2与TFF3可以调节紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的表达，保护肠上皮细胞屏障的完整性进而降低通透性。　　6、TLR2与TFF3能够抑制炎症性肠上皮细胞屏障炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的释放，维持肠上皮细胞屏障的功能。　　7、TLR2对TFF3mRNA及蛋白表达有调控作用，且不依赖于PI3K/Akt通路。　　8、TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障通透性的保护作用依赖于PI3K/Akt通路的激活。　　9、TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的的调节作用有PI3K/Akt通路参与。　　10、TLR2和TFF3对炎症性肠上皮细胞屏障炎性细胞因子TNF-α，IL-6，IL-8调节作用由PI3K/Akt通路介导。