论文部分内容阅读
第一部分TAD差异miRNAs在人主动脉血管平滑肌细胞中的表达验证目的：检测芯片差异miRNAs在IAVSMC中的表达含量。方法：①从已知胸主动脉夹层与正常主动脉中膜芯片分析结果中挑选出差异表达的38个miRNAs;②设计38对miRNA引物；③人主动脉血管平滑肌细胞传代培养；④提取总RNA,进行RT-PCR检测,分析结果。结果：38个miRNAs在HAVSMC中均有表达,其中12个呈高表达,8个呈中度表达,18个呈低表达。结论：HAVSMC不同miRNA的表达水平存在差异。第二部分功能性miRNAs高内涵筛选目的：筛选出对HAVSMC具有明确功能的miRNAs。方法：①慢病毒/腺病毒转染HAVSMC预实验,确定病毒载体；②从上述表达验证的38个miRNAs中挑选出20个miRNA;③明确miRNA模拟表达趋势(上调/下调),构建相应的腺病毒载体,转染]HAVSMC。④基于Cellomics高通量筛选系统,实时细胞计数,检测细胞增殖。结果：①腺病毒对HAVSMC更敏感；②各实验组,连续5天,记录细胞数,细胞生长状态良好,组间细胞增殖存在差异。结论：筛选出的14/20个miRNA对HAVSMC增殖功能有影响；HCS应用于miRNA的批量筛选,准确、稳定、可信度高。miR-320a靶向调节MMP9抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖迁移功能目的：探讨miR-320a对血管紧张素Ⅱ诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMC)增殖迁移功能的影响及潜在的机制。方法：建立HAVSMC培养体系,①RT-PCR检测miR-320a mimics转染人主动脉血管平滑肌细胞的效率；②CCK-8细胞增殖法,检测血管紧张素Ⅱ对人主动脉血管平滑肌细胞作用的时间、浓度曲线以及miR-320a对AngⅡ诱导的HAVSMC增殖作用的影响；③细胞划痕、transwell验证miR-320a对AngⅡ诱导的HAVSMC迁移功能的影响；④RT-PCR检测miR-320a作用于HAVSMC后的MMP9的mRNA表达水平变化；⑤Western Blot检测人主动脉血管平滑肌细胞MMP-9蛋白水平变化以及MAPK/ERK通路蛋白的表达变化。结果：AngⅡ显著促进人主动脉血管平滑肌细胞增殖；niR-320a过表达抑制AngⅡ诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖及迁移功能；miR-320a过表达明显降低MMP-9的mRNA及蛋白表达；miR-320a过表达明显降低ERK1/2蛋白水平的表达。结论：miR-320a靶向调节MMP-9水平抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖迁移功能；MAPK/ERK通路可能参与上述过程。