第一部分培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼不同时序对肺腺癌细胞作用的体外研究背景目前,肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中85%以上为非小细胞肺癌,且腺癌占较大比例,临床确诊时多为晚期患者,丧失了手术时机,对于晚期肺腺癌患者,化疗是必选的治疗方法之一,其中,培美曲塞做为一种新型化疗药物,与其他化疗药物相比具有更好的耐受性,目前已广泛应用于进展期肺腺癌的一线治疗。培美曲塞主要作用机制是通过抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶拮抗叶酸代谢,从而阻断核酸合成而抑制肿瘤生长。然而,培美曲塞并没有改善肺腺癌患者的治疗有效率及总生存期,其疗效已进入平台期,无论近期还是远期,疗效均不是十分理想。近几年来,随着分子技术的日益发展,分子靶向药物治疗已成为肺腺癌的研究重点,在肺腺癌治疗中已占据非常重要的地位。对于具有活化表皮生长因子受体突变的肺腺癌患者,表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂已成为最有效的一线治疗,然而许多证据表明,表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂并不是对所有基因突变的患者均有效。对于表皮生长因子受体基因突变敏感的晚期肺腺癌患者,虽然表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂作为一线药物推荐使用,但IPASS、OPTIMAL等Ⅲ期临床研究提示,非小细胞肺癌患者接受EGFR-TKIs单独治疗并未发现总生存期获益,无进展生存期在10-13个月左右后出现继发性耐药,且客观有效率IPASS 43%;OPTIMAL 83%。探索更好的综合治疗方法迫在眉睫,为进一步探索新的治疗方法以期延长进展生存期,提高客观有效率,许多学者提到化疗是否可以联合EGFR-TKIs治疗非小细胞肺癌,故很早,化疗联合EGFR-TKIs的治疗模式就有诸多研究,但结论不一。目的1.明确野生型A549细胞、EGFR外显子19突变型HCC827细胞及T790M继发耐药型H1975细胞三种肺腺癌细胞在培美曲塞、埃克替尼/厄洛替尼联合用药时序上的疗效差距。2.进一步探索A549细胞、HCC827细胞及H1975细胞三种肺腺癌细胞在培美曲塞、埃克替尼/厄洛替尼不同联合用药时序上疗效差距的机制。方法1.细胞株的选择对于肺鳞癌患者不推荐应用EGFR-TKIs,所以我们采用三种肺腺癌细胞株,A549为野生型细胞株,H1975为T790M继发耐药型细胞株,HCC827为EGFR外显子19突变型细胞株。2.药物的选择(1)进展期肺腺癌患者的一线化疗药物:培美曲塞(2)分子靶向药物:埃克替尼、厄洛替尼。3.实验顺序的设定(1)埃克替尼/厄洛替尼应用48h,然后培美曲塞单独应用24h;(2)培美曲塞应用24小时,埃克替尼/厄洛替尼应用48h;(3)培美曲塞+埃克替尼/厄洛替尼同时应用48h,培养基应用24h。4.CCK-8法检测细胞增殖活力,明确培美曲塞、埃克替尼/厄洛替尼的IC50,并计算联合指数CI。5.根据流式细胞学检测法检测细胞凋亡及周期分布。结果1.CCK-8 结果(1)培美曲塞在A549、HCC827、H1975细胞的IC50值分别为1.9000±0.2037umol/L、1.5780±0.2504umol/L、3.3723±0.0824umol/L。(2)埃克替尼在A549、HCC827、H1975细胞的IC50值分别为7.7273±0.8093umol/L、0.0042±0.0007umol/L、5.7983±0.998lumol/L。(3)厄洛替尼在A549、HCC827、H1975细胞的IC50分别为6.6643±0.3404umol/L、0.0034±0.0005umol/L、4.8120±0.0576umol/L。(4)培美曲塞序贯埃克替尼的联合指数(CI)在A549,HCC827和H1975细胞分别为 1.00±0.06、0.67±0.12、0.61±0.07。(5)培美曲塞序贯厄洛替尼的联合指数(CI)在A549,HCC827和H1975细胞分别为 1.00±0.09、0.68±0.12、0.72±0.03。(6)埃克替尼序贯培美曲塞联合指数(CI)在A549,HCC827 和 H1975细胞分别为 1.00±0.08、1.04±0.18、1.03±0.14。(7)厄罗替尼序贯培美曲塞的联合指数(CI)在A549,HCC827和H1975细胞分别为 1.02±0.06、1.00±0.11、1.00±0.05。(8)埃克替尼联合培美曲塞同时应用的联合指数(CI)在A549,HCC827和H1975 细胞分别为 1.46±0.22、1.30±0.20、1.20±0.15。(9)厄洛替尼联合培美曲塞同时应用的联合指数(CI)在A549,HCC827和H1975 细胞分别为 1.29±0.05、1.37±0.41、1.27±0.08。CCK-8结果显示培美曲塞及埃克替尼、厄洛替尼均能抑制A549、HCC827、H1975细胞增殖,且呈浓度依赖性。在HCC827和H1975细胞,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼有一协同作用(CI<1),埃克替尼/厄洛替尼序贯培美曲塞有相加作用(CI=1),培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用有拮抗作用(CI>1)。而在A549细胞,培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用有拮抗作用(CI>1),培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼有一相加作用(CI=1),埃克替尼/厄洛替尼序贯培美曲塞有相加作用(CI=1),故在A549细胞无论培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用、培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼及厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞均未发现存在协同作用。2.细胞凋亡结果(1)培美曲塞序贯埃克替尼的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为 6.36±0.65%,30.22±7.97%和 18.12±5.09%。(2)培美曲塞序贯厄洛替尼的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为 5.26±0.3%,50.47±8.68%,20.1±4.07%。(3)埃克替尼序贯培美曲塞的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为 5.54±0.77%,18.8±0.64%,11.5±1.37%。(4)厄罗替尼序贯培美曲塞的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为 5.83±1.3%,17.91±1.35%,11.05±2.03%。(5)埃克替尼联合培美曲塞同时应用的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为 6.13±1.89%,11.27±2.26%,11.76±1.97%。(6)厄罗替尼联合培美曲塞同时应用的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为 5.71 ±0.36%,14.35±0.57%,10.77±0.26%。(7)空白组的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为1.39±0.59%,1.47±0.38%和 1.41±0.43%。(8)培美曲塞组的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为6.11±1.81%,6.13±0.96%和 7.55±0.56%。(9)埃克替尼组的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为4.59±0.33%,6.82±0.55%和 9.89± 1.64%。(10)厄罗替尼组的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为3.55±1.14%,7.41±0.41%和 7.56±0.79%。细胞凋亡结果显示在HCC827和H1975 mm,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼治疗组中凋亡率明显高于其他组,具有显著疗效(P<0.05)。但在A549细胞无明显差异(P>0.05)。3.细胞周期结果(1)A549、HCC827、H1975细胞在培美曲塞组中S期明显升高,S期比例分别为 34.11±1.43%、34.46 ± 1.88%、34.48 ± 1.26%。(2)A549、HCC827、H1975细胞在埃克替尼中G1期明显升高,G1期比例分别为 65.97±3.77%、63.78±2.48%、63.02±1.30%。(3)A549、HCC827、H1975细胞在厄洛替尼组中G1期明显升高,G1期比例分别为 65.56±2.55%、67.33±2.60%、65.51±1.71%。(4)A549、HCC827、H1975细胞在培美曲塞序贯厄洛替尼组中S期明显升高,S 期比例分别为 46.34±4.64%、55.74±7.38%、46.82±6.08%,Gl、G2 期下降。(5)A549、HCC827、H1975三组细胞在培美曲塞序贯埃克替尼中S期也明显升高,S期比例分别为43.37±0.69%,49.26±2.96%、44.05±2.93%,G1、G2期下降。(6)A549、HCC827、H1975三组细胞在厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞及厄洛替尼/埃克替尼联合培美曲塞同时应用组中Gl、G2及S期的比率变化未发现明显规律性。结果提示培美曲塞在A549、HCC827、H1975三组细胞均阻滞于S期,埃克替尼/厄洛替尼在A549、HCC827、H1975三组细胞均阻滞于G1期,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼在A549、HCC827、H1975三组细胞S期明显升高,提示培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼加强了对S期的阻滞。结论1.培美曲塞及埃克替尼、厄洛替尼均能抑制A549、HCC827、H1975细胞增殖,呈浓度依赖性;先埃克替尼/厄洛替尼48h后培美曲塞24小时应用对HCC827、H1975细胞有相加作用,培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用48h对HCC827、H1975细胞作用有拮抗作用,先培美曲塞24h后埃克替尼/厄洛替尼48h对HCC827、H1975细胞有协同作用,在A549细胞,无论培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用、培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼及厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞均未发现有协同作用。2.在HCC827和H1957细胞,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼组凋亡率较厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞组及培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用组明显升高,而在A549细胞,无论培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用、培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼及厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞凋亡率均无明显影响。3.埃克替尼/厄洛替尼对A549、HCC827、H1975三种细胞作用后均阻滞于G1期,培美曲塞对A549、HCC827、H1975三种细胞均阻滞于S期。培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼在A549、HCC827、H1975三组细胞S期均明显升高,加强了培美曲塞对三种细胞S期的阻滞,分析培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼发生协同作用及其凋亡率增高考虑其机制可能与细胞周期相关。第二部分培美曲塞联合二甲双胍对肺腺癌细胞作用的体外研究背景目前,肺癌是病死率较高的恶性肿瘤之一,预后极差,86%的患者在确诊后5年内死亡,进展期肺癌病人约占85%,只有15%的患者在确诊时病变局限,5年生存率可达50%。其中大部分患者在初诊时已处于ⅢB～Ⅳ期,失去了手术治疗时机,难以通过手术根治,所以治疗主要依赖化疗或放疗等综合治疗方法,这些可能是肺癌病死率较高的主要因素之一,而其中腺癌是最常见的组织学类型。培美曲塞因其用药效果确切,且与其他细胞毒药物相比毒性最小,目前推荐其用于晚期非小细胞肺癌的一线治疗方案,近年来培美曲塞成为肺腺癌的研究热点。培美曲塞作为多靶点抗叶酸化疗药,可以抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶,从多个途径阻碍胸腺嘧啶和嘌呤的生成,干扰叶酸代谢和核苷酸形成,进而达到阻碍癌细胞生长的目的,并且能使肿瘤细胞的耐药性降低,它主要的毒副作用是骨髓抑制和黏膜炎,一般能通过采取摄入叶酸制剂和维生素B12的方式降低其毒副作用发生率。但多项研究表明,与其他化疗药物如多西紫杉醇等相比培美曲塞也难以提高患者的存活率。所以,整体效果不容乐观。寻找新的辅助药物来加强化疗效果以便提高肺腺癌患者的生存率是目前研究的热点。二甲双胍作为一种耐受良好的双胍类降糖药物,被全球1.2亿多例的2型糖尿病患者用作一线药物控制血糖。自20世纪70年代Dilman V M等学者研究发现双胍类抗糖尿病药物具有抗老化能力和抗癌作用以来,二甲双胍吸引了众多的肿瘤研究者。许多研究发现长期服用二甲双胍的2型糖尿病病人并发结直肠癌、肺癌等癌症的风险明显降低,且在2型糖尿病合并癌症的患者中服用二甲双胍能明显降低死亡率。诸多体外研究及动物实验也发现二甲双胍有抑制癌细胞增殖、促进凋亡的作用,并发现二甲双胍对肿瘤细胞的抑制作用主要可能通过激活肺癌细胞中AMPK,进而激活JNK/p38MAPK信号通路,JNK、p38表达增加,使诱导生长停滞和DNA破坏基因GADD153基因表达增加激活进而诱导肺癌细胞凋亡。与此同时研究还发现二甲双胍联合化疗药物顺铂或足叶乙甙等化疗药物可以抑制肺癌细胞增殖,并提高肺癌细胞对顺铂或足叶乙甙等化疗药物的敏感性,但目前关于二甲双胍与培美曲塞联合用于肺腺癌细胞的研究尚未报道。目的1.明确二甲双胍联合培美曲塞在体外是否对肺腺癌细胞有抑制增殖、促进凋亡、影响细胞周期及减弱迁移能力的作用。2.进一步探讨其相关分子机制。方法1.细胞株的选择我们采用三种肺腺癌细胞株,A549为野生型细胞株,H1975为T790M继发耐药型细胞株,HCC827为EGFR外显子19突变型细胞株。2.实验方法的设定(1)二甲双胍、培美曲塞单药及联合作用于三种肺腺癌细胞48小时后,通过CCK8检测法检测IC50值,并计算联合指数(CI),进而明确二甲双胍联合培美曲塞是否有抗增殖作用及治疗疗效。(2)根据流式细胞学检测法检测细胞凋亡及周期分布。(3)Transwell法检测经应用药物治疗后三种肺腺癌细胞迁移能力的变化。(4)通过蛋白质印迹检测来进一步明确其相关机制。结果1.CCK-8 结果(1)经应用二甲双胍48小时后,A549,HCC827和H1975细胞的IC50值分别为 11.92±0.11mmol/L,4.72±0.14 mmol/L 和 5.41±0.55 mmol/L。(2)经应用培美曲塞48小时后,A549,HCC827和H1975细胞的IC50值分别为 1.82±0.17 umol/L,1.54±0.30 umol/L 和 3.37±0.14umol/L。(3)二甲双胍与培美曲塞联合应用48小时后,在A549,HCC827和H1975细胞的联合指数CI分别为0.56,0.63和0.64。结果提示二甲双胍单独应用能显著降低三种肺腺癌细胞系的增殖,并呈浓度依赖关系方式。二甲双胍联合培美曲塞同时应用对肺腺癌细胞的抗增殖作用起到协同的作用(CI<1)。2.细胞凋亡结果(1)二甲双胍单独治疗48小时在A549,HCC827和H1975细胞的凋亡率分别为 10.40 ± 0.57%,16.28±1.21%,12.68 ± 1.67%,较空白组明显增多(P<0.05)。.(2)培美曲塞单独治疗48小时在A549,HCC827和H1975细胞的凋亡率分别为 14.26±1.17%,14.65±0.84%及 13.22± 1.60%,较空白组明显增多(P<0.05)。(3)二甲双胍联合培美曲塞同时应用48小时的凋亡率分别为24.34±3.62%,35.55±3.25%和 28.54±4.07%,较培美曲塞组明显增多(P<0.05)。(4)空白组48小时在A549,HCC827和H1975细胞的凋亡率分别为1.39±0.59%,2.02±0.68%,1.47±0.38%。结果提示在A549,HCC827和H1975三种肺腺癌细胞,二甲双胍单独应用较空白组有明显增强细胞凋亡作用(P<0.05),二甲双胍与培美曲塞联合应用较单独培美曲塞组有明显增强细胞凋亡作用(P<0.001)。3.细胞周期结果(1)A549,HCC827 和 H1975 细胞,空白组的 G1 期分别为 74.75±0.35%,62.48± 1.39%,53.25± 1.88%;S 期分别为 18.67±1.27%,22.86±0.52%,29.37±2.11%;G2 期分别为 6.59±1.33%,14.66±0.97%,17.38±0.69%。(2)二甲双胍应用48小时治疗组在A549,HCC827和H1975细胞的G1期分别为 68.03±1.70%,41.36±0.70%,46.18±0.48%;S期分别为 20.69±4.64%,43.18±7.07%,28.03±1.54%;G2 期分别为 11.36±4.54%,15.46±7.7%,25.79±4.95%。A549细胞,二甲双胍单独治疗组相较于空白组对细胞周期无明显影响(P>0.05);HCC827细胞,二甲双胍单独治疗组相较于空白组引起S期的升高(P<0.01);H1975细胞,二甲双胍单独治疗组相较于空白组引起G2期比例增加(P<0.05),总之二甲双胍对A549,HCC827和H1975细胞的细胞周期影响未发现共同规律性。(3)培美曲塞应用48小时治疗组在A549,HCC827和H1975细胞的G1期分别为 46.43±0.38%,61.41 ±4.18%,64.83± 1.06%;S 期分别为 53.38±3.34%,33.02±-3.32%,4.00±3.64%;G2期分别为0.67±0.65%,5.57±1.03%,25.79±4.95%。(4)二甲双胍联合培美曲塞48小时治疗组在A549,HCC827和H1975细胞G1 期分别为 43.54±5.64%,36.43±1.28%,64.80±4.92%;S 期分别为 51.48±10.99%,62.48±0.97%,30.79±6.17%;G2期分别为7.20±5.91%,1.09±0.48%,4.41±1.35%。A549细胞,二甲双胍联合培美曲塞治疗组相较于培美曲塞组对细胞周期无明显影响(P>0.05);HCC827细胞,二甲双胍联合培美曲塞治疗组相较于培美曲塞组S期的比例明显升高(P<0.01);H1975细胞,二甲双胍联合培美曲塞治疗组相较于培美曲塞组S期的比例明显升高(P<0.01)。总之二甲双胍联合培美曲塞48小时治疗组对A549,HCC827和H1975细胞的细胞周期影响未发现共同规律性。总之,二甲双胍单独治疗及二甲双胍联合培美曲塞治疗对A549,HCC827和H1975三种细胞的细胞周期影响均未发现共同规律性,分析二甲双胍单药及二甲双胍联合培美曲塞对肺腺癌细胞的作用可能与细胞周期关系不大。4.Transwell实验结果二甲双胍单独治疗较空白组明显抑制了三种肺腺癌细胞的迁移能力(P<0.05);二甲双胍联合培美曲塞治疗组较培美曲塞单独治疗组也明显抑制了三种肺腺癌细胞迁移作用(P<0.05)。5.通过蛋白质印迹分析,在A549、HCC827、H1975细胞系中,二甲双胍单独治疗组与空白组比较发现,二甲双胍治疗组Bcl-水平降低,Bax水平升高(P<0.05);二甲双胍联合培美曲塞治疗组与培美曲塞治疗组比较发现,二甲双胍联合培美曲塞治疗组Bcl-2水平降低,Bax水平升高(P<0.05)。这些结果提示,二甲双胍单独应用及二甲双胍联合培美曲塞同时应用均能显著增强肺腺癌细胞的凋亡,故分析二甲双胍对肺腺癌细胞的抗增殖及对化疗药物的增敏作用机制可能通过细胞凋亡发生。结论本研究结果表明二甲双胍单药及二甲双胍联合培美曲塞同时应用均能能抑制肺腺癌细胞株的生长,增强细胞凋亡,减弱迁移能力,并且其机制可能通过诱导细胞凋亡来发挥相关作用。我们的数据表明二甲双胍单药在体外对肺腺癌细胞有明显抗肿瘤作用,同时二甲双胍对化疗药物培美曲塞在抑制肿瘤方面有明显的增敏作用,这对临床上的2型糖尿病病人无论其是否合并肿瘤,在选择降糖药物方面可能有一定指导作用,但我们的研究只是在体外进行,尚需大量其他的相关研究、动物实验及临床研究来进一步证实。