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目的:胰腺癌是严重威胁人类健康的一种常见恶性肿瘤,发病率呈逐年增高的趋势,并有手术切除率低,术后复发率高的特点,使胰腺癌成为实体肿瘤中治疗效果较差的肿瘤之一。免疫治疗的发展,使它成为胰腺癌综合治疗中有效手段之一。
目前,许多肿瘤相关抗原已相继被发现。其中肿瘤-睾丸抗原(cancer-testisantigen,CTA)研究工作最早源于上世纪70年代末到80年代初,其在肿瘤组织中的表达具有以下特征:①同一肿瘤-睾丸(cancer-testis,CT)抗原在不同肿瘤组织的表达频率不同;②不同CT抗原在同一肿瘤组织的表达频率也不同;③CT抗原的表达具有“群集性”,即同一肿瘤组织可同时表达多种CT抗原。基于CT抗原的这些特征,筛选出各种肿瘤组织中高表达的CT抗原显得尤为重要,这将为肿瘤疫苗的制备提供坚实的理论基础。
为了寻找胰腺癌中高表达的CT抗原,本实验检测并比较了肿瘤-睾丸抗原、滑膜肉瘤X断裂点基因(synovialsarcomaXbreakpiont,SSX)-2、SSX-4、黑色素瘤抗原(melanomaantigen,MAGE)-A1在胰腺癌以及癌旁组织中的表达情况,为临床研制、应用肿瘤疫苗提供可靠的理论基础。
方法:
选取2008年河北医科大学第二医院肝胆外科胰腺癌手术切除病例26例,癌组织均经病理证实;癌旁组织取自癌缘外2cm以内的胰腺组织,且经病理证实;另外选取河北医科大学第二医院病理科2005年至2007年间手术切除、病例资料完整的存档蜡块,其中包括癌旁组织15例和胰腺癌52例。病例入组前所有病例的全部切片均由两位高年资病理医师严格按照2000年WHO标准明确诊断复核。
免疫组织化学检测SSX-2、SSX-4、MAGE-A1抗原表达采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(即S-P法)。结果判定按照Volm报道的判断标准进行,根据以下两方面的总分进行判断:(1)选染色均匀的阳性表达区域,以着色细胞占视野细胞总数的多少分级。0:无阳性细胞;1:阳性细胞数<25%;2:阳性细胞数26%~50%;3:阳性细胞数>50%。(2)按着色细胞染色强弱分:0:阴性;1:弱,淡黄色;2:中等,棕黄色;3:强,棕褐色。按(1)、(2)的数值相加判断结果,0~2为阴性(-):3~4为弱阳性(+);5~6为强阳性(++)。
RT-PCR检测CT抗原在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达。使用组织RNA提取试剂盒进行总RNA的提取,电泳鉴定后反转录合成cDNA并进行扩增。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶分析系统中观察、照相并进行定量分析。
结果:
1免疫细胞化学染色结果在15例胰腺癌旁组织中肿瘤-睾丸抗原SSX均不表达,52例胰腺癌中,其阳性表达率为25例(48.08%)。两者相比P值小于0.01,表明SSX在癌旁组织不表达,在癌组织中表达。两者存在显著性差异。肿瘤-睾丸抗原MAGE-A1蛋白在15例癌旁组织中均不表达,其阳性表达率为0例(0%);在52例胰腺癌中,其阳性表达率为15例(28.85%),两者相比P值小于0.05,表明两者存在显著性差异。
2RT-PCR结果以MAGE、SSX-2、SSX-4与GAPDH灰度比值表示各CT抗原mRNA的相对表达量。胰腺癌组织和癌旁组织SSX-2/GAPDH灰度比值分别为1.60±0.39和0.76±0.15;SSX-4/GAPDH灰度比值分别为1.46±0.18和0.66±0.15;MAGE/GAPDH灰度比值分别为1.44±0.20和0.80±0.10。三者在胰腺癌中的表达均显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。SSX-2在胰腺癌中表达水平比SSX-4,MAGE-A1表达水平高。
结论:
结果显示:肿瘤-睾丸抗原SSX-2、SSX-4、MAGE-A1在胰腺癌癌旁组织中免疫组织化学法检测均未发现阳性表达;胰腺癌中,SSX-2、SSX-4、MAGE-A1基因的mRNA及蛋白出现不同频率的表达,显示不同种类的肿瘤-睾丸抗原在胰腺癌中的表达存在显著差异,其中SSX的阳性表达明显高于MAGE-A1的表达,且SSX-2的阳性表达率高于SSX-4,提示将SSX基因不同产物抗原决定簇整合,作为胰腺癌的特征性抗原,制备肿瘤疫苗,参与胰腺癌的治疗。