铁作为细胞内很多关键酶类的辅基,以及参与电子呼吸链和多种氧化还原反应,对于生物体维持正常的生命活动是至关重要的。铁元素虽然在地壳中的含量占第4位,但是在生理pH和有氧的条件下,Fe2+很容易被氧化为Fe3+,并形成稳定的不溶性的Fe(OH)3,导致环境中可利用的铁远远不能满足生物体的正常需求。因此在长期的进化过程中,微生物发展出了一系列的从环境中获取铁的途径,其中最普遍的方式是合成和分泌铁载体。通常细菌产生不止一种铁载体,由于环境中铁的不足,利用铁载体实现对铁的争夺是细菌之间竞争的一个重要方式。因此普遍认为,发达并受精确调控的多铁载体系统,可以增加微生物对环境的适应性并赋予其生存竞争优势。HYS菌株是本实验室从东湖水域中分离得到的一株高产铁载体的假单胞菌,其在限铁的MKB培养基中,用CAS检测液测定法测定出的产铁载体能力,是几种常见假单胞菌的3-4倍,这暗示了HYS具有特殊的铁摄取和代谢系统。为了更有针对性地研究HYS菌株铁载体合成调控机理,首先对HYS进行转座子诱变,筛选相关基因。从19635株接合子中共筛选得到了60株在CAS检测平板上产铁载体能力相比野生型发生改变的突变株。通过TAIL-PCR、半随机引物PCR和转座子挽救的方法,得到了所有60株突变株转座子插入位点侧翼序列,并将其在HYS基因组上定位。其中在CAS平板上可正常生长的38株突变株,共涉及22个基因。为后续研究HYS铁载体合成调控机理提供了遗传学素材和信息。为了深入研究HYS铁载体,首先对其所产铁载体的类型进行了确定。由于HYS所产铁载体在紫外下可以发出微弱的荧光,通过敲除假单胞菌中常见的荧光类铁载体pyoverdine合成关键基因,我们发现HYS可同时分泌非荧光和荧光两类铁载体,其中非荧光铁载体占绝大部分。对培养物上清中铁载体吸收峰进行确定,非荧光铁载体的特征吸收峰为330nm和392nm,而荧光铁载体pyoverdine为文献报道的405nm。对两类铁载体的特性进行比较,发现两者分泌规律、分泌的铁浓度条件及使用效率均有较大差异。首先,非荧光铁载体在对数期开始大量分泌,稳定期前即达到最大值,而荧光类的pyoverdine则从对数期到稳定期一直稳步增加,但是分泌量远小于非荧光铁载体。其次,非荧光铁载体倾向于在轻度限铁条件下分泌,而pyoverdine在极端限铁条件下分泌。最后,在使用效率上pyoverdine大于非荧光铁载体。由于这两类性质不同的铁载体的共存和分工,HYS菌株可以通过两者的协调更好地适应外界多变的环境条件。清楚了HYS产生两类铁载体后,选取转座子诱变筛选中得到的相关基因,研究它们与HYS铁载体的相关性。其中双组份系统GacS/GacA和一个由12个ORF构成的基因簇引起了我们的兴趣。GacS/GacA是在革兰氏阴性菌中普遍存在并高度保守的全局调控系统,已经报道其与多种次级代谢物(氰化物、蛋白酶类、毒力因子、生物控制因子等)的产生相关,负责细菌致病性和抑菌性等多种生物学功能。但是其与铁载体这种普遍存在的次级代谢物的关系目前还知之甚少。通过构建GacS/GacA相关的一系列衍生菌株,揭示了在HYS菌株中GacS/GacA通过Gac/Rsm信号通路正调控非荧光铁载体的产生,而与此相反,其敲除导致荧光铁载体pyoverdine略微上调。这种GacS/GacA系统对同一菌株的多种铁载体具有不同调控效应的现象尚未见报道。而这种不同的调控策略与两类铁载体的不同性质以及在不同铁浓度环境下分泌可以相对应。HYS很可能就是通过这两种不同的作用,实现两类铁载体的差异分泌和精确调控。除了上游的全局调控系统GacS/GacA外,在转座子诱变实验中还得到了一个基因簇,其中的多个基因被多次筛选检出,表明其与HYS产铁载体相关。这个基因簇长约14kb,由12个ORF构成。通过比对分析发现,在其他已测序的菌株中并没有类似排布的基因簇存在,此基因簇中基因预测的编码产物也并未报道与铁载体直接相关。此外,12个ORF中的6个都与其他属的菌株具有最高的同源性。由于此基因簇的特殊性,研究清楚其与铁载体的关系将增加对铁载体生物合成途径的认识。我们首先对转座子插入突变株铁载体产量受到了影响的9个ORF进行基因敲除,结果显示其中7个基因的敲除株非荧光铁载体产生受阻,1个敲除株非荧光铁载体产量略有上升,初步确定了此基因簇负责非荧光铁载体的合成,并将其命名为nfs(nonfluorescent siderophore)基因簇。接下来选取了其中orf1,orf9-6,orf12的启动子区研究其活性与外界铁浓度的关系。结果表明高铁浓度条件下三个启动子的活性均会受到不同程度的抑制,说明在不同的铁浓度下,HYS可以通过调控nfs基因簇的表达来控制非荧光铁载体的产生。此外orf9-6和orf12启动子活性受gacA严格的正调控,orf1也略受gacA正调控,说明GacS/GacA系统对非荧光铁载体调控的下游靶标确实是nfs基因簇。综上所述,本研究通过转座子诱变筛选得到了一系列HYS铁载体相关基因,为HYS及其他菌株铁载体相关机理研究提供了遗传学信息；揭示了HYS中两类不同性质铁载体的共存和分工,以及双组分系统GacS/GacA对它们的不同调控作用,增加了对细菌铁载体分泌策略和调控模式及其意义的认识；用遗传学方法证实了一个新的基因簇与HYS高产非荧光铁载体合成相关,并发现其表达受GacS/GacA系统调控,初步勾勒了HYS高产的非荧光铁载体从上游调控到下游合成的通路,为铁载体的生物合成和调控提供了更多的参考和借鉴。