心血管疾病是当今全世界范围内导致人类猝死的重要原因之一。缓慢型心律失常和心肌梗死(myocardialinfarction,MI)都是心血管疾病中最常见的疾病。植入传统的埋藏式电子起搏器仍是各种有临床症状的缓慢型心律失常患者的第一选择。但电子心脏起搏器在临床实际应用中仍有许多不能避免的现实问题,如需要定期程控定期更换、心脏收缩不同步化、静脉血栓栓塞、不受神经系统调控等问题。目前生物起搏器已成为新的研究热点。现普遍认为细胞联合基因起搏最有发展前景。即通过转染不同的起搏基因到不同的干细胞中,再将其移植到心脏模型中,从而使其表现出异位起搏活动。现阶段对心脏起搏的主要认识均集中在内向超极化电流起搏电流,而超极化激活的环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cychc nucleotide-gated channel,HCN)基因家族是编码主要起搏电流的基因,与心脏起搏细胞的产生及调控关系最为密切。由HCN家族及其编码的If为产生起搏活动的关键因素,HCN4是窦房结和房室结中表达最丰富的亚型,发挥控制心率的主要作用。目前已在动物模型上证实转染基因作为生物起搏是一种可行的实验方法,但体内实验均未有超过6周,推测可能与选用的基因载体有关。伴随干细胞为基础的再生医学研究的不断进展,公认的有较大潜能的干细胞主要包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)和极小胚胎样干细胞(very small embryonic like stem cell,VSELs)。与iPSCs、MSCs相比较,VSELs体积小,更幼稚,分化能力更强,经血液输注不易导致栓塞,发展前景较大。虽然心脏生物起搏器取得了令人鼓舞的进展,但绝大多数在体实验有效生物起搏持续时间都不长,没有取得人们期望的效果。只有系统地对这些问题进行研究,才能构建高效、稳定、长久、可应用于临床的新一代生物起搏器。本研究前两部分研究以下问题:1.VSELs的体外分离、培养、扩增和优化分选及生物学特性鉴定;2.建立适宜的VSELs细胞向心脏起搏样细胞定向诱导分化体系、探索HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。中医学上认为MI属于胸痹范畴,患者自觉外感寒邪,进入体内以致气血虚瘀滞,寒邪无阻,胸阳弱寒邪强,气血瘀滞、心脉闭塞而导致发病。临床上尚无有效根治手段。利用干细胞动员促进MI修复为临床治疗提供了新思路。VSELs数量极少,限制了其临床应用。正常状态下VSELs处于静止状态,只有发生应激/损伤时如急性MI的条件下VSELs才会动员到外周血中,但数量仍然很低。近年来研究发现重组人粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)可动员VSELs至外周血,具有促进MI后的组织修复和改善心功能的作用,并且这些VSELs具有向心肌等细胞分化的能力,参与其他组织特异性干细胞的分化,促进组织器官的再生,为临床上提供有效数量的VSELs开辟了新途径。虽然西药治疗MI取得了一定治疗效果,但疗效较单一,作用时间不持久、存在副作用等诸多缺陷。而中药因治疗作用广泛而越来越受到人们重视。中医上认为MI的治疗应注重活血化瘀,通经活络,扶正祛寒,补血祛淤,阴阳平衡等。中成药麝香保心丸含有人工麝香,人参提取物,牛黄,肉桂,苏合香,蟾酥、冰片等七种药物成分,其中麝香味辛性温,可活血化瘀,开窍提神;人参补气健脾,具有益气扶正作用;牛黄清心开窍;肉桂温阳通脉;苏合香芳香温通,达芳香开窍之效;蟾酥开窍止痛、可强心益气;冰片有加强止痛开窍之效。诸药可达到降心火、祛寒邪、通气机、活血化瘀、舒张血管、增强心肌功能的疗效。本研究第三部分将通过建立兔心肌梗死模型,探讨在G-CSF动员联合应用麝香保心丸治疗心肌梗死的效果及二者的协同作用,从而为提供有效数量的VSELs应用于临床开辟了新路径。本课题共分三大部分,分别讨论以下问题:1.VSELs的体外分离、培养、扩增和优化分选及生物学特性鉴定;2.建立适宜的VSELs细胞向心脏起搏样细胞定向诱导分化体系、探索HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路;3.rhG-CSF动员联合麝香保心丸治疗心肌梗死的实验研究。第一部分猪骨髓极小胚胎样干细胞的分离、培养及鉴定目的:建立猪骨髓极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells,VSELs)的体外分离、纯化鉴定体系,探索优化分选VSELs的流程,明确VSELs的生物学特性。方法:获取猪骨髓后,采用红细胞裂解法从猪骨髓中分离单个核细胞,运用相关特异性抗体CD45,Lin及CXCR4标记,使用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选获得VSELs,将乳猪成肌细胞作为饲养层培养,使用光学显微镜及透射电镜观察猪骨髓VSELs的形态特征、增殖情况和超微结构,并采用免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色的方法鉴定干细胞标志的表达。结果:采用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选的方法,可从猪骨髓中分离到贴壁生长的细胞,与骨髓间充质干细胞相比,这些细胞体积小、形态均一,不易扩增,且表达多潜能抗原标志SSEA-1、Oct-4、Nanog和Sox-2,同时碱性磷酸酶染色阳性。VSELs呈核大胞浆少特点,胞核中可见部分细胞器结构,呈现明显幼稚细胞特点。定量PCR及凝胶电泳结果显示VSELs细胞高表达CD133、SOX-2、OCT-4、NANOG等干细胞特异性基因。结论:采用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选技术可以从猪骨髓中分离到表达多潜能干细胞标志的VSELs。第二部分基于HCN转染VSELs构建生物起搏信号通路筛选诱导剂研究目的:建立适宜的VSELs细胞向心脏起搏样细胞定向诱导分化体系、探索HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。方法:①参照MSCs的诱导分化体系,将纯化的P2代VSELs细胞接种于铺有基质胶的24孔板中,用成神经细胞诱导培养液(1640+体积分数为10%胎牛血清+RA/IBMX)、成脂细胞诱导培养液(体积分数为10%胎牛血清的1640培养基+0.5μmol/L地塞米松+10 mg/L胰岛素+0.5 mmol/LIBMX+50mol/L吲哚美辛)、心肌细胞诱导液(10μmol/L5-Aza+无血清基础培养基)替换各诱导孔的VSELs细胞培养液。每隔24h仔细观察添加诱导剂后细胞的形态变化;②用胰酶将处于对数生长期的P2代VSELs细胞制成细胞悬液,在裸鼠的右侧腋窝皮下、腹腔各注射200μl细胞悬液,注射细胞后每日观察裸鼠的生长、饮食、精神活动等状况;③HCN基因慢病毒质粒载体转染及转染后诱导分化,构建MSCs、VSELs诱导分化过程关键基因的信号通路。慢病毒载体构建成功后,提取质粒备用,将传代后的MSCs、VSEL接种于24孔板,细胞增殖至每孔面积70%时,按照Fugen转染体系分别转染HCN1、2、4基因,转染后添加基础培养基正常培养,分别于转染后12h、24h、48h观察绿色荧光,计数转染效率;④全细胞膜片钳记录稳定转染HCN阳性VSELs起搏离子通道电流:将转染阳性的MSCs、VSELs细胞用0.25%胰酶消化后,加入细胞外液。在光镜和荧光显微镜下选择带有绿色荧光的单个干细胞进行实验,用微操纵器将玻璃微电极缓慢靠近细胞,将玻璃微电极轻轻压于细胞中央后轻轻给予玻璃微电极负压吸引,等待电极尖端与细胞膜表面形成1GΩ以上的高阻封接,补偿电极电容,给玻璃微电极内轻施脉冲式负压进行破膜,使细胞与电极内液直接相通而与细胞外液绝缘,补偿细胞膜电容及串联电阻,由此构建全细胞记录模式记录离子流。结果:①通过对VSELs体外分化能力鉴定发现,VSELs诱导神经元样细胞甲苯胺蓝染色鉴定阳性;VSELs诱导脂肪样细胞油红染色阳性;VSELs诱导心肌样细胞免疫荧光结果显示心肌样细胞特异性蛋白阳性,由此证实了 VSELs具有多向分化潜能;②VSELs裸鼠成瘤实验发现注射VSELs的裸鼠的生长、饮食、精神活动等状况均良好,皮下注射位置未见明显肿瘤包块形成,腹腔未触及肿块形成。连续观察1月后处死裸鼠,剥离皮肤及腹腔内组织,在注射位置均未分离得到肿瘤组织;③HCN基因慢病毒质粒载体可成功转入MSCs、VSEL细胞中,且48h时荧光信号最强;④HCN转染后MSC及VSELs细胞均可检测到典型电流信号,不同亚型HCN基因转染后膜电流强度不同,相同HCN基因转染MSC及VSELs所得电流强度也存在差别。结论:我们将所培养的VSELs诱导分化为神经元样细胞、心肌样细胞和脂肪样细胞确立了其具有三胚层细胞分化的特性,不具有恶性增殖成瘤性能。将HCN基因慢病毒质粒载体转染至VSELs,建立了 VSELs诱导分化为心脏起搏样细胞定向诱导分化体系,探索了HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。第三部分rhG-CSF动员联合麝香保心丸治疗心肌梗死的实验研究目的:研究麝香保心丸联合重组人粒细胞集落刺激因子(recombinat human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)动员基础上对急性心肌梗死兔的治疗作用。方法:以普通健康大耳兔为研究对象,全麻下开胸结扎冠状动脉左前降支近段建立心肌梗死模型。动物模型分为对照组(Ⅰ组)、rhG-CSF动员组(Ⅱ组)、麝香保心丸喂养组(Ⅲ组)、rhG-CSF动员与麝香保心丸联合喂养组(Ⅳ组)。观察各组动物治疗前后一般情况,测定各组动物治疗前后心功能并于6周后取心脏组织作相关病理检查。结果:与Ⅰ组相比,其余三组动物治疗后一般情况均改善,左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)明显增加(P<0.05),左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDd)明显缩小,室壁运动显著增强;心肌梗死面积明显缩小(P<0.05),梗死区毛细血管数目显著增多(P<0.05)。Ⅳ组与Ⅱ组相比,LVEF进一步增加(P<0.05),LVEDd缩小无明显差异(P>0.05),左室后壁运动增强。毛细血管数目显著增多(P<0.05),心肌梗死面积变化无统计学差异(P>0.05)。结论:麝香保心丸、rhG-CSF动员以及在此基础上加用麝香保心丸喂养均可改善急性心肌梗死兔的一般情况,改善心功能,缩小心肌梗死面积,促进血管增生,而rhG-CSF动员联合麝香保心丸干预后心功能改善及血管增生更为明显。