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DELLA蛋白是赤霉素信号途径的关键负调控因子,是连接环境信号和植物生长发育以及环境适应的桥梁。植物感受来自环境中的胁迫信号后,赤霉素合成受到抑制,DELLA蛋白则保持相对稳定,不易被降解,导致植物生长受抑制,对逆境耐受力增强。研究人员对拟南芥 DELLA基因家族在胁迫下表达模式的分析以及基因芯片表达谱数据聚类分析显示拟南芥中五个DELLA基因的表达在冷、热、缺氧的环境条件下并没有明显升高的趋势,甚至有些基因表达水平有所降低。与拟南芥不同,实验室前期研究发现花生 AhDELLA3a和 AhDELLA3b基因会受到干旱和高盐胁迫的强烈诱导。本研究利用转基因植物分析了花生AhDELLA家族基因在干旱、高盐等逆境胁迫下的功能,克隆了AhDELLA1启动子并对其活性进行了研究,对诱导型 AhDELLA3a启动子进行了分区研究,旨在找出其关键顺式元件,进而钓取上游调控因子,从而为阐明 AhDELLA家族基因在花生抵抗逆境胁迫中的功能奠定基础。 本研究主要内容包括:⑴花生DELLA家族基因转基因植物抗逆性检测:实验室前期已经获得异源表达花生DELLA家族基因AhDELLA1、AhDELLA2和AhDELLA3a的转基因烟草,对获得的转基因烟草在苗期进行干旱和高盐胁迫处理,观察 AhDELLA转基因烟草对胁迫的抗性,检测抗性相关生理指标的变化情况。实验结果证明,胁迫处理后三种 AhDELLA转基因烟草的长势均比野生型烟草好,AhDELLA转基因烟草和野生型烟草叶片中SOD、POD酶活性均随胁迫处理时间的延长而升高,而三种AhDELLA转基因烟草中的SOD、POD酶活性比野生型烟草中升高更显著。在盐处理培养基上观察 AhDELLA转基因烟草种子与野生型烟草种子的萌发率,结果表明三种 AhDELLA转基因烟草的萌发率均明显升高。由此可初步推断AhDELLA家族基因AhDELLA1、AhDELLA2和AhDELLA3a均在花生抵抗干旱和高盐胁迫中具有重要作用。⑵AhDELLA1和 AhDELLA3a转基因花生的获得:将植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLA1和pCAMBIA2300-AhDELLA3a导入农杆菌c58c1,利用花萼管注射法分别将AhDELLA1和AhDELLA3a基因转化花生。收获花生种子提取DNA并进行PCR鉴定,得出 pCAMBIA2300-AhDELLA1载体的转化效率约为7%,pCAMBIA2300-AhDELLA3a载体的转化效率约为6%,下一步将在后代中继续检测转基因阳性植株,排除假阳性。⑶AhDELLA1启动子克隆和活性分析:克隆 AhDELLA1基因的启动子序列,构建GUS表达载体 pCAMBIA1381z-AhDELLA1pro::GUS,导入农杆菌 LBA4404,通过农杆菌介导的叶盘转化法侵染野生型烟草叶片,获得 AhDELLA1启动子的转基因植株。对AhDELLA1启动子转基因烟草的幼年叶片、成年叶片、根、茎、花和未成熟种子进行GUS组织化学染色,结果表明在转基因烟草的这些器官中均能检测到GUS的表达;对获得的启动子转基因烟草幼苗进行盐胁迫处理,与对照相比,胁迫处理以后转基因烟草GUS表达明显增强,表达部位主要集中在叶片,在下胚轴中也有少量表达。GUS组织化学染色表明AhDELLA1启动子响应高盐胁迫。⑷AhDELLA3a启动子分区与关键调控元件的分析:前期工作中证明 AhDELLA3a启动子在逆境胁迫下具有胁迫诱导特性,为筛选上游调控因子,我们拟鉴定 AhDELLA3a启动子上的关键调控元件。生物信息学分析显示 AhDELLA3a启动子中含有多个胁迫调控元件,为进一步了解这些顺式作用元件的功能,根据这些顺式作用元件在启动子上的位置,设计不同的启动子缺失片段区域,构建启动子缺失片段系列植物表达载体,用农杆菌LBA4404,通过叶盘转化法侵染野生型烟草叶片,获得了 AhDELLA3a启动子各缺失片段的转基因植株。