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目的:肾小球硬化是多种肾脏病慢性进展至终末期肾衰竭的共同途径,因此,探讨肾脏纤维化的有效防治有重要意义。转化生长因子(TGF-β1)在肾小球硬化过程中起重要作用。来氟米特(leflunomide,LEF)是一种免疫抑制剂。本实验选用不同浓度来氟米特进行干预研究,观察来氟米特( leflunomide, LEF)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激大鼠肾小球系膜细胞表达Ⅳ型(ColⅣ胶原)及Smad2/3表达的影响。探讨其对TGF-β1/Smad信号传导通路的作用,为来氟米特的肾脏保护作用提供理论依据。方法:采用体外培养大鼠肾小球系膜细胞的经典方法进行系膜细胞(GMC)的复苏、培养、传代和鉴定后3~10代用于实验。实验分组:(1)对照组(Ctrl), (2)刺激组(TGF-β1,5ng/ml), (3)LEF-1组(5μg/ml)+ TGF-β1(5ng/ml), (4)LEF-2组(50μg/ml)+ TGF-β1(5ng/ml)。分别于不同作用时间点(15min、30min、1h、2h、6h)①用间接免疫荧光法检测P-Smad2/3表达的情况;②用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定细胞培养上清液的ColⅣ胶原蛋白表达量的变化。③采用荧光半定量RT-PCR法检测Smad2mRNA表达的变化;结果:①间接免疫荧光结果P-Smad2/3在对照组只有微量的表达,在TGF-β1(5ng/ml)刺激后30min细胞荧光着色显著增强且集中在胞核及周边。激活至少持续2h,2h蛋白表达回落,细胞荧光着色转淡并散在细胞质中。与TGF-β1刺激组相比加上LEF(5μg/ml)、(50μg/ml)组P-Smad2/3蛋白表达下降,细胞荧光强度随时间延长及浓度加大而减弱。②细胞上清液检测结果在对照组ColⅣ胶原仅有少量基础性分泌。与对照组相比TGF-β1(5ng/ml)刺激在30min、1h时间点ColⅣ胶原分泌量显著上升(P<0.05),其刺激作用呈时间依赖关系15min开始上升30min达高峰后ColⅣ胶原分泌量较前下降。与TGF-β1(5ng/ml)刺激组相比加上LEF(5μg/ml)、(50μg/ml)的抑制组ColⅣ胶原蛋白表达量明显下降在30min到1h有显著差异(P<0.05)。但两抑制组在2h及6h时间点ColⅣ胶原蛋白表达量无显著差异。无统计学意义。随时间增加抑制率增加说明其抑制作用也呈时间依赖性关系。③荧光定量PCR结果TGF-β1(5ng/ml)刺激组与对照组比较:Smad2mRNA在大鼠系膜细胞表达水平TGF-β1(5ng/ml)刺激组组显著高于对照组、加LEF处理(5μg/ml)、(50μg/ml)组的Smad2mRNA表达水平显著低于TGF-β1(5ng/ml)刺激组组(F=11.836 P<.0001)。结论:1.人重组TGF-β1(5ng/ml)能显著上调体外培养的大鼠肾小球系膜细胞P-Smads蛋白的表达。2. TGF-β1/Smad信号传导途径在大鼠肾小球系膜细胞的激活能够引起ColⅣ胶原分泌增多,其作用呈一定的时间依赖关系。3.来氟米特能部分阻断TGF-β1/Smad信号传导通路在大鼠肾小球系膜细胞的激活,降低Smad2蛋白和mRNA的表达,抑制ColⅣ胶原的分泌,其抑制作用呈一定的时间依赖关系。