论文部分内容阅读
背景与目的:大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是引起奶牛子宫内膜炎的主要致病菌之一,该病给奶牛养殖业带来了严重的经济损失,探究早期奶牛子宫内膜炎的诊断指标,做到早发现、早治疗显得尤为重要。益生菌作为潜在的抗生素替代品,治疗和预防奶牛子宫内膜炎的机制还不甚明确。因此,本试验通过研究鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacill rhamnosus GR-1,L.rhamnosus GR-1)抗E.coli致奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的作用机制,为其临床应用提供理论依据。方法:根据对产后200头荷斯坦奶牛第21 d阴道内分泌物性状和子宫内容物细胞学检查,选取21头奶牛分为三组:临床型子宫内膜炎组(CE,n = 7);亚临床型子宫内膜炎组(SE,n = 7)和健康对照组(HC,n = 7)。分别于产后1d、7 d、14 d、21 d和30 d采集血清,使用全自动生化分析仪测定血清中酶活性及离子浓度变化;使用ELISA方法检测血清中炎性细胞因子和急性期蛋白的变化。利用原代奶牛子宫内膜上皮细胞(BEECs),评估L.rhamnosus GR-1抗E.coli致BEECs损伤的作用机制。试验分为四个组:对照组(CONT);大肠杆菌组(ECOL);提前3h加入鼠李糖乳杆菌GR-1组(LRGR);提前3 h加入鼠李糖乳杆菌GR-1后再加入大肠杆菌组(LRGR+ECOL)。E coli添加浓度为 1×105 CFU/mL,L.rhamnosus GR-1 添加浓度为 1×107 CFU/mL。通过倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察BEECs形态学和超微结构变化;利用流式细胞术检测BEECs的凋亡情况;Western Blot方法检测细胞紧密连接蛋白及信号通路蛋白表达;Real-time PCR方法检测细胞相关受体及炎性因子表达。结果:产后7 d,CE组血清中AST的水平显著高于HC组;产后14 d、21 d和30 d,CE组血清中CK的水平显著高于HC组,且产后21d,SE组血清中CK的水平显著高于HC组。产后21d和30d,CE组血清中TNF-α的水平显著高于HE组和SE组;产后7d、14d、21d和30d,CE组血清中Hp的水平显著高于HC组,且在产后7d、14d和21d,SE组血清中Hp的水平显著高于HC组。L.rhamnosus GR-1减弱了E.coli诱导的细胞结构损伤,显著降低了细胞凋亡率。L.thamnosusGR-1显著降低了E.coli感染细胞导致的模式识别受体(TLR2,TLR4,NOD1和NOD2),炎性体(NLRP3,ASC 和 Caspase-1),TLR4 下游衔接分子(MyD88 和 TICAM2),负调控因子TOLLIP,转录调控因子(NF-κB和IRF3),炎性细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-18和IFNβ)等免疫反应分子mRNA表达水平的增加。L.rhanmsosus GR-1显著提高了E.coli导致的紧密连接蛋白claudin-1/2、Occludin及ZO-1表达减少,显著降低了 NF-κB2和p65的表达。结论:奶牛血清中TNF-α和Hp水平可以作为临床型子宫内膜炎的辅助诊断指标。与其他诊断指标相比,奶牛血清中Hp对炎症的敏感性更高可以作为亚临床型子宫内膜炎的辅助诊断指标。L.rhamnosus GR-1通过衰减MyD88依赖性和非依赖性信号传递途径的信号转导,以及加强NLRs和TLRs之间的相互作用,抑制E.colE诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路激活,进而减少了炎性细胞因子的释放,同时缓解了E.coli对细胞紧密连接的破坏,减少了细胞的凋亡率,从而减轻了E coli诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞的炎性损伤作用。