ECRG4基因在胃癌组织中的表达及胃癌细胞株中的干预研究

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目的:研究ECRG4基因在胃癌组织、胃癌癌旁组织及正常胃组织中的表达差异及其与患者临床病理特征的相关性。明确胃癌细胞与正常胃上皮细胞ECRG4mRNA、蛋白定量差别,并在不同时间点以不同浓度去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)干预胃癌细胞,从细胞生长状态、细胞活力、细胞周期、增殖指数等方面判断去甲基化药物对胃癌细胞株的影响,最后鉴定ECRG4mRNA及蛋白在干预后的表达情况。方法:收集我院2009年01月至2011年12月胃癌手术后病理科保存胃癌石蜡标本58例作为胃癌组,收集癌旁组织15例作为癌旁组、同期术后证实为良性疾病的胃组织15例作为正常组,以免疫组化方法检测ECRG4基因的表达情况并分析其与临床病理参数的关系。以不同浓度(OμM、5μM、1OμM)5-Aza-CdR干预胃癌细胞SGC7901,在不同时间点(24h、48h、72h)以倒置显微镜观察细胞生长情况、MTT测定细胞活力、PI单染流式细胞术分析细胞周期变化。以RT-PCR及VVestern blot方法分别定量检测胃癌细胞SGC7901、正常胃上皮细胞GES-1中ECRG4mRNA及其编码蛋白的表达,再以不同浓度(OpM、5μM、10μM)5-Aza-CdR干预SGC7901,48小时后再次以RT-PCR及Western blot方法检测ECRG4mRNA及其编码蛋白的表达恢复情况。结果:1、ECRG4蛋白在胃癌组织中普遍表达下调或缺失,在癌旁组织中部分下调或缺失,在胃正常组织普遍表达,三者差异有统计学意义(F=2.819,P<0.001)。组间两两比较得正常组与胃癌组、癌旁组与胃癌组均有统计学差异。而正常组与癌旁组比较无统计学差异。光学显微镜下可见淡黄至棕黄色着色阳性表达主要定位于细胞质、细胞膜。ECRG4的表达与胃癌患者的分化程度有关(χ2=8.357,P<0.05),与病人年龄、性别、肿瘤发生部位及是否淋巴结转移无关(χ2=0.284-2.636, P>0.05)。2.5-Aza-CdR干预48h、72h后,倒置显微镜观察发现SGC7901细胞排列紧密程度减弱,细胞间隙增宽,堆砌生长有分散趋势,且10gM药物处理组比5μM药物处理组作用更加明显。3、MTT检测显示SGC7901细胞在5-Aza-CdR干预24小时后,药物浓度10μM组与对照组相比,OD570值减小具有统计学意义(P<0.05);干预48、72小时后,药物浓度5μM、10μM组与对照组相比,OD570值均减小,差异具有统计学意义(P<0.01);与药物浓度5μM组相比,以10μM5-Aza-CdR处理细胞后,自48小时开始,OD570值减小,差异具有统计学意义(P<0.01)。4、以5-Aza-CdR处理胃癌细胞株SGC7901,随着处理浓度和时间的增加,细胞周期发生变化,呈现G1期阻滞,细胞增殖指数也逐渐减小,其中与对照组及5μM5-Aza-CdR干预组相比,以10μM5-Aza-CdR干预48小时后细胞增殖指数减小有统计学意义(P<0.05)。5、以5-Aza-CdR干预SGC7901细胞48小时,RT-PCR显示0μM组、5μM组与GES-1组ECRG4mRNA相对表达量增加具有统计学差异(P<0.05),10μM组
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