论文部分内容阅读
百合(Lilium spp.)是百合科百合属植物,其品种广泛应用于花卉产业,部分百合的鳞茎目前也开发为食品及药品,具有很高的经济价值。食用百合以鳞茎为食材;切花百合的开花早晚与开花数量也与鳞茎的大小相关,故百合鳞茎膨大极具研究价值。鳞茎种球的膨大主要依靠淀粉的累积,从生物淀粉合成代谢的角度来看,了解淀粉合成相关酶的基因及其表达模式、分析各个因素与淀粉含量之间的相关性,以得到影响淀粉合成的关键因素,为百合种球快速繁殖提供分子基础,且AGPase小亚基基因与淀粉合成及淀粉含量正相关,可作为百合筛选高淀粉含量种质的标记,为快速鉴定百合新品种提供新途径,这也对百合的种球生产具有积极的意义。本研究对亚洲百合川百合(Lilium davidii),东方百合‘白佩琪’,铁炮百合‘萨利’三类百合的大棚生长发育过程中的不同时期进行了淀粉含量以及淀粉合成限速酶AGPase酶活性的测定;对AGPase的三个亚基基因进行了克隆;采用q PCR对AGPase三个亚基基因的表达量进行测定并对其表达模式进行了分析;借助R语言进行皮尔逊相关性分析并得到相关性情况;最后进行了内参基因的筛选。主要结果如下:1.鳞茎淀粉含量测定的结果表明,三类百合都在倒苗期淀粉含量最高,川百合为209 mg/g、‘白佩琪’为184 mg/g、‘萨利’为151 mg/g;在花期淀粉含量最低,川百合为100 mg/g、‘白佩琪’为127 mg/g、‘萨利’为66 mg/g。同一时期(花期)不同组织的淀粉含量结果表明,叶片中淀粉含量远低于鳞片,花期时川百合、‘白佩琪’、‘萨利’的叶片淀粉含量分别为33 mg/g、47 mg/g、11 mg/g。同一时期(花期)不同组织的AGPase酶活性结果表明叶片中AGPase酶活性远高于鳞片,此时期川百合、‘白佩琪’、‘萨利’的叶片酶活性分别为475 U/g、984 U/g、407 U/g;而此时期鳞片的酶活仅分别为5 U/g、4 U/g;7 U/g。在鳞片的不同发育阶段,不同类型百合的酶活性变化趋势与淀粉含量变化趋势是相似的,花期最低,倒苗期最高。倒苗期川百合、‘白佩琪’、‘萨利’的鳞片酶活性分别为29 U/g、32 U/g;35 U/g。2.克隆得到三类百合每类3个AGPase的亚基基因序列。结构预测的结果说明克隆的基因表达后构成的蛋白在结构上都与同一个AGPase相似;保守结构域功能预测说明克隆的基因表达后构成的蛋白执行淀粉合成相关分子功能及糖原合成相关生物学功能。系统进化的结果显示两个大亚基与浙贝母的进化距离很近,且小亚基的进化树中,本次克隆得到的AGPS序列与浙贝母和已经报道的7种百合的进化距离均很近,由此可以推测AGP基因可能在百合科植物间都具有较高的保守性。3.表达性分析结果表明大亚基在不同百合中表达趋势总体是相似的。AGPL1在三类百合中都是花期达到最高的表达量且出苗期和倒苗期表达量相差不大,但是在不同百合中,具体的表达水平有较大的差异,川百合中,花期表达量是出苗期的2.5倍左右,‘白佩琪’中花期约为出苗期的2倍左右,但是在‘萨利’中,其花期表达量为出苗期的近10倍;AGPL2在‘萨利’和川百合中三个时期表达几无差异,但是在‘白佩琪’中呈现为花期表达约为出苗期的7倍,倒苗期约为出苗期的4倍。小亚基在三类百合中的表达趋势都相似,且表达水平在三类百合中差异也不大。4.内参基因的筛选分别得到了三类百合各自不同组织(花期鳞片及花期叶片);不同发育阶段(出苗期,花期,倒苗期)以及综合最稳定的内参基因。所有样品、不同发育阶段、不同组织的鳞茎内参基因都是BHLH和ACT综合稳定性最佳。此外,也得到了不同百合间不同组织,不同发育阶段以及综合因素的最稳定内参基因。‘萨利’所有样品和不同发育阶段的鳞茎都是EIF和BHLH综合稳定性最佳,不同组织间GAPDH和EIF的稳定性最佳。川百合所有样品和不同发育阶段的鳞茎都是BHLH和GAPDH综合稳定性最佳,不同组织间GAPDH和EIF的稳定性最佳。‘白佩琪’所有样品的鳞茎为EIF和ACT综合稳定性最佳,不同发育阶段为BHLH和EIF综合稳定性最佳,不同组织间EIF和ACT的稳定性最佳。所得的结果可以细致的指导后续所需的定量实验。5.鳞茎所测数据的相关性分析的结果表明鳞茎的淀粉含量与AGPase酶活性及AGPS基因表达量高度线性正相关,相关系数分别为0.87及0.73,且数据之间存在显著性差异;此外,小亚基基因AGPS与酶活性也呈现出高度线性正相关,相关系数为0.89,数据之间也存在显著性差异,即AGPase小亚基基因的表达量与百合淀粉含量及酶活性都表现出正相关,说明小亚基基因是影响AGPase活性及淀粉合成的关键因子。叶片所测数据的相关性分析表明,叶片中3个AGPase基因之间都高度线性正相关,相关系数分别为0.82,0.80,0.87,这与鳞片中的三个基因的相关性模式不同,说明这三个基因在叶片中与在鳞片中可能存在不同的协同表达模式,故推测百合AGPase不同亚基基因也存在组织特异性表达。所得结果的分析为百合中后续AGPase的相关研究提供了可重点着眼于小亚基基因表达、大小亚基表达量差异及二者的相互作用的思路;也为鳞茎的繁育提供了可通过过表达或基因编辑等技术调节淀粉合成限速酶小亚基基因表达及调节其酶活性以促进百合鳞茎膨大的实践思路。