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牛流行热（bovine ephemeral fever,BEF）是一种由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）引起的急性热性的动物疫病,多发于黄牛、奶牛和水牛,临床上主要表现为高热、食欲不振、肌肉僵硬、眼鼻分泌增多、跛行、流产和奶牛产奶量下降。该病广泛分布于非洲、大洋洲、亚洲及中东的40多个国家。在我国台湾省和大陆26省区的黄牛、水牛、奶牛、牦牛均有该病报道。在实验室诊断方面,目前已建立了病毒分离、RT-PCR和荧光定量RT-PCR等核酸检测方法以及微量中和实验、抗体ELISA等血清学诊断方法,但无BEFV抗原的检测方法或商品化试剂盒,给田间样品的病毒筛查造成了困难。本研究选取BEFV抗原G蛋白为靶点,设计特异性引物,利用RT-PCR扩增BEFV JT02L毒株G基因并克隆至pGEM-Teasy载体中。测序表明,JT02L毒株G基因开放阅读框长为1872 bp,编码623个氨基酸,其G1、G2、G3、G4抗原位点与我国LYC11、Henan2012、Shandong2011等分离株抗原位点高度一致。进而将编码4个抗原位点的1482 bp的G基因片段亚克隆至pPROEXHTb原核表达载体,经测序验证后转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,Ni-NTA系统纯化获得约70 Ku的目的蛋白,免疫新西兰大耳白兔制备获得了高效价的具有良好反应原性的多克隆抗体。利用制备的多克隆抗体为捕获抗体包被酶标板,以抗G1表位的单克隆抗体为检测抗体,建立抗原捕获ELISA,确定捕获抗体、检测抗体、HRP标记的山羊抗小鼠二抗最佳稀释度分别为1:1000、1:1200、1:5000,与水泡性口炎病毒、狂犬病毒灭活抗原、牛病毒性腹泻病毒抗原无交叉反应。采集甘肃省武威市天祝藏族自治县7个乡镇共计224头白牦牛的全血和抗凝血,利用建立的抗原捕获ELISA方法,结合抗体间接ELISA、荧光定量RT-PCR方法进行检测。在7个乡镇的白牦牛均检出BEFV抗体,但无BEFV抗原检出。白牦牛BEFV抗体总体阳性率为45.09%（101/224）,不同乡镇白牦牛BEFV感染率存在较大差异（31.0366.67%）。荧光定量RT-PCR结果表明BEFV核酸阳性率为37.5%（84/224）。以获得的G基因3’端420bp区段测序并构建系统发育树表明,白牦牛群BEFV流行毒株与中国大陆1976年分离的JB76H毒株亲缘关系较近,为BEFV基因亚型I。进一步分析了建立的抗原捕获ELISA在BEFV分离鉴定中的应用价值。以JT02L牛体传代病毒静脉接种感染2头实验公牛,并于牛体39.042.0℃发热期采集抗凝血,分离淋巴细胞并接种至MDBK细胞,盲传后收集细胞培养物,以建立的抗原捕获ELISA检测病毒抗原。在第3代培养物中检测到BEFV抗原,进而对细胞培养物中BEFV进行基因组测序表明JT02L毒株全长为14941 nt,与GenBank中收录的BEFV基因组结构类似但α3和β蛋白编码区较长,并且β和γ基因间隔含38 nt的AT丰富区,可能与病毒毒力相关。这些结果表明,本研究建立的抗原捕获ELISA可以用于BEFV抗原检测,为BEFV的筛查、分离鉴定奠定了基础。