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组织与器官的损伤后修复与功能重建是医学领域研究的重大课题,随着干细胞技术和生物材料科学的发展,再生医学与组织工程领域备受关注。通过组织工程将种子细胞引入受损部位,在支架材料的引导与支持下,促进缺损部位的再生与修复。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多能干细胞,具有多向分化潜能,在不同的诱导条件下能够分化成多种不同的间质细胞,如成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等。MSCs存在于多种组织中,并且在组织的损伤修复过程中起着重要的作用,其中骨髓来源MSCs的成骨分化是骨缺损后修复重建过程中成骨细胞的重要来源之一。已有大量研究报道磁场能促进骨损伤的修复,同时近年来国内外有关磁性骨支架材料的研究进展迅速,然而目前关于磁性材料是否能影响、如何影响MSCs的分化能力知之甚少。在本文的研究中,我们使用本课题组自主研发的、可用于临床的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Iron oxide nanoparticles,IONPs),研究其对人骨髓来源MSCs的作用及相关机理,期望为氧化铁纳米颗粒用于骨组织再生修复治疗的进一步研究提供指导。具体来说,主要工作包括以下几个方面:(1)氧化铁纳米颗粒对MSCs的毒性研究发现氧化铁纳米颗粒与MSCs共孵育的72小时内,随着时间推进颗粒逐渐进入细胞,且主要分布于内吞体或溶酶体内;定量分析发现,MSCs对于氧化铁纳米颗粒的摄入具有时间和浓度依赖性。急性毒性方面,使用CCK-8实验检测共孵育24小时后的细胞活力,结果表明100、200和400μg/m L的氧化铁纳米颗粒使细胞活力分别下降了5.69%、7.45%和8.65%;长时毒性方面,100μg/m L氧化铁纳米颗粒共孵育21天后细胞乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)的释放仅增加了2.87%,且细胞凋亡率均维持在5%以下。(2)氧化铁纳米颗粒对MSCs作用的基因组学研究基于前期细胞相容性实验结果,使用100μg/m L氧化铁纳米颗粒与MSCs共孵育7天,对细胞基因组表达水平的变化进行基因芯片分析,并与目前已知数据库进行比对。检测出2092个上调的编码基因和1631个下调的编码基因,以此为据可以研究氧化铁纳米颗粒与MSCs的复杂作用机制。通过对表达水平显著变化的基因进行DAVID分析,得到了Gene Ontology基因功能注释和KEGG信号传导途径受到纳米材料的影响规律,也印证了基因表达差异是细胞对氧化铁纳米颗粒的应答调控过程。其中基因功能注释富集结果显示,氧化铁纳米颗粒可能会协助MSCs的成骨分化。(3)氧化铁纳米颗粒协助促进MSCs成骨分化的研究不同浓度氧化铁纳米颗粒与MSCs共孵育,分别于7至14天后测定细胞碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性、21天后对细胞外基质钙化结节进行染色,结果表明100μg/m L氧化铁纳米颗粒能够协助促进MSCs成骨分化。细胞形貌的扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)与分化标志物免疫印迹实验进一步证实了这一效应。此外,通过与铁离子和包覆材料PSC的对照,显示这种协助促进作用来自于完整的颗粒性质。在KEGG信号通路的分析中,发现了MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号通路可能是影响氧化铁纳米颗粒协助成骨分化效应的重要因素。对此通路的激活及其与成骨分化的关系进行了研究后发现,氧化铁纳米颗粒能够激活MAPK信号通路从而协助促进MSCs成骨分化。(4)长链非编码RNAs参与氧化铁纳米颗粒协助MSCs成骨分化研究使用长链非编码(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)芯片研究了氧化铁纳米颗粒协助促进MSCs成骨分化后lnc RNAs表达变化,发现了411个上调的lnc RNAs和605个下调的lnc RNAs。对差异lnc RNAs和m RNAs的共表达分析,并分析了对显著差异的共表达m RNAs的DAVID信号通路,发现lnc RNAs可能主要通过影响RTKs/MAPK和BMPs/Smads信号通路、肌动蛋白重排和细胞磁场感知而参与氧化铁纳米颗粒促进的MSCs成骨分化。(5)Lnc RNA-INZEB2调控氧化铁纳米颗粒协助成骨分化效应的机制研究验证了芯片结果中差异表达显著的lnc RNAs的表达水平后,发现lnc RNALOC105373660的表达随着孵育时间逐渐增加,序列比对后发现其转录本位于ZEB2基因2号内含子的反向重复序列,故将其命名为INZEB2。降低它的表达会明显下调氧化铁纳米颗粒的协助促进成骨分化效应,这说明INZEB2的存在对于维持氧化铁纳米颗粒协助促进的成骨表型至关重要。ZEB2是抑制Smads激活的成骨分化的重要蛋白,下调ZEB2的表达可以恢复降低INZEB2所抑制的成骨分化,证明INZEB2是通过ZEB2来调控氧化铁纳米颗粒协助促进的MSCs成骨分化。进一步地,发现INZEB2通过影响ZEB2转录本的可变剪切抑制ZEB2蛋白表达水平,从而重新激活被ZEB2所抑制的Smads依赖的成骨分化。(6)磁刺激对氧化铁纳米颗粒协助成骨分化效应的作用及机制研究应用Helmholtz线圈产生均匀可调电磁场用于细胞磁刺激,发现了低强度静磁场可以增强氧化铁纳米颗粒协助促进的成骨分化效应;使用不同磁化强度的颗粒与细胞共同孵育,发现氧化铁纳米颗粒对成骨分化的促进作用依赖于其自身的磁性。磁场与颗粒磁性对细胞成骨分化的作用都依赖于磁受体蛋白Mag R的表达。对磁刺激后细胞进行蛋白质组分析,发现磁场与磁性氧化铁纳米颗粒影响焦点黏着与ECMs-受体相互作用相关蛋白的表达。进一步的研究表明,磁刺激可以通过改变细胞内actin应力纤维的排列影响细胞力学性质,从而促进成骨分化的发生。