丹参酚酸A对脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路的影响

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目的:通过研究丹参酚酸A对脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路的影响,探讨丹参酚酸A对脑缺血神经保护作用的潜在机制。  方法:体内实验:研究丹参酚酸A对脑缺血后细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响。54只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组,每组18只。采用线栓法制作永久性大脑中动脉闭塞模型。丹参酚酸A组于造模后0 h及造模后6 h,舌静脉注射丹参酚酸A,其余各组注射等体积生理盐水。造模后24h时按 Bederson评分标准行神经功能评分,采用2,3,5-氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测脑梗死体积。HE染色检测缺血侧皮质区形态学改变,TUNEL原位标记法检测缺血侧皮质区细胞凋亡,免疫组化及蛋白质印迹法检测缺血侧皮质区Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表达。  体外实验:进一步明确丹参酚酸A可通过激活Wnt/β-catenin信号通路而减轻脑缺血损伤。成年雄性Sprague-Dawley大鼠,共制作海马脑片36片,每组9片。海马脑片随机分为空白对照组、氧糖剥夺组、丹参酚酸A组和丹参酚酸A+Wnt/β-catenin通路特异性抑制剂 XAV-939组。缺氧缺糖人工脑脊液模拟脑缺血损伤环境,双极电极刺激CA3区Schaffer侧枝,玻璃电极接收CA1区辐射层海马诱发电位信号,BL-420F生物机能实验系统测出兴奋性突触后电位的斜率( slope excitatory postsynaptic potentials,S-EPSP)。  结果:体内实验:(1)神经功能缺损评分:假手术组、脑缺血组、丹参酚酸A组Bederson评分分别为(0.000±0.000)、(3.722±1.018)、(2.444±0.705),三组间Bederson评分差异有统计学意义(F=52.482, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组Bederson评分显著增高(P<0.05);与脑缺血组相比,丹参酚酸A组Bederson评分显著降低(P<0.05)。(2)脑梗死体积检测:假手术组、脑缺血组、丹参酚酸A组脑梗死体积分别为(0.000±0.000mm3)、(212.702±8.029mm3)、(79.038±10.665mm3),三组间脑梗死体积差异有统计学意义(F=1459.000, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组脑梗死体积显著增加(P<0.05);与脑缺血组相比,丹参酚酸A组脑梗死体积显著减少(P<0.05)。(3)HE染色:假手术组神经细胞形态无异常,胞膜、核膜清晰,核仁明显;脑缺血组大量神经细胞形态异常,胞体皱缩成三角形,胞浆嗜伊红深染,核固缩或溶解;丹参酚酸A组少量神经细胞形态异常,胞体皱缩成三角形,胞浆嗜伊红深染,核固缩或溶解。与假手术组相比,脑缺血组呈中重度缺血改变;与脑缺血组相比,丹参酚酸A组呈轻中度缺血改变。(4)神经细胞凋亡检测:假手术组、脑缺血组、丹参酚酸A组神经细胞凋亡数分别为(2.000±1.414)、(30.333±2.251)、(18.833±2.041),三组间神经细胞凋亡差异有统计学意义(F=325.386, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组神经细胞凋亡数显著增加(P<0.05);与脑缺血组相比,丹参酚酸A组神经细胞凋亡数显著减少(P<0.05)。(5)免疫组织化学方法检测Wnt3a、p-GSK-3β及β-catenin表达:① Wnt3a表达:假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组的Wnt3a的表达分别为(0.194±0.011)、(0.155±0.008)、(0.163±0.002),3组间存在显著性差异(F=21.054,P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组Wnt3a表达显著降低(P<0.05);与脑缺血组相比,丹参酚酸A组Wnt3a表达显著增高(P<0.05)。② p-GSK-3β表达:假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组的p-GSK-3β的表达分别为(0.143±0.005)、(0.188±0.004)、(0.162±0.012),3组间存在显著性差异(F=41.318, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组p-GSK-3β表达显著增高(P<0.05);与脑缺血组相比,丹参酚酸A组p-GSK-3β表达显著降低(P<0.05)。③β-catenin表达:假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组的β-catenin的表达分别为(0.249±0.018)、(0.144±0.013)、(0.194±0.043),3组间亦存在显著性差异(F=56.587, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组β-catenin表达显著降低(P<0.05);与脑缺血组相比较,丹参酚酸A组的β-catenin表达显著增高(P<0.05)。(6)蛋白质印迹定量Wnt3a、p-GSK-3β及β-catenin表达:① Wnt3a:假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组Wnt3a表达水平分别为(1.000±0.190)、(0.800±0.185)、(1.198±0.262),3组间存在显著性差异(F=9.621, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组Wnt3a表达显著降低(P<0.05);与脑缺血组相比较,丹参酚酸A组的Wnt3a表达显著增高(P<0.05)。② p-GSK-3β:假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组p-GSK-3β表达水平分别为(0.650±0.150)、(1.290±0.250)、(1.190±0.250),3组间存在显著性差异(F=19.668, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组p-GSK-3β表达显著增高(P<0.05);与脑缺血组相比较,丹参酚酸A组的p-GSK-3β表达显著降低(P<0.05)。③β-catenin:假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组β-catenin表达水平分别为(1.200±0.210)、(0.500±0.120)、(1.100±0.220),3组间存在显著性差异(F=33.385, P<0.05)。与假手术组相比,脑缺血组β-catenin显著降低(P<0.05);与脑缺血组相比较,丹参酚酸A组的β-catenin表达显著增高(P<0.05)。  体外实验:空白对照组、氧糖剥夺组、丹参酚酸 A组及丹参酚酸 A+ XAV-939组的S-EPSP变化分别为(100.00±0.00%)、(51.25±13.68%)、(89.50±7.46%)、(62.65±5.22%),4组间存在显著性差异(F=57.383, P<0.05)。与空白对照组相比,氧糖剥夺组S-EPSP变化显著降低(P<0.05);与氧糖剥夺组相比,丹参酚酸A组S-EPSP变化显著增高(P<0.05);与丹参酚酸A组相比较,丹参酚酸A组+XAV-939的S-EPSP变化显著降低(P<0.05)。  结论:(1)进一步证实丹参酚酸A对脑缺血损伤具有保护作用。  (2)丹参酚酸A可减轻脑缺血后神经细胞凋亡。  (3)丹参酚酸A可通过激活 Wnt/β-catenin信号通路而发挥脑保护作用。
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