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瘤胃尿素分解菌分泌的脲酶可以水解尿素为氨,氨可被微生物吸收利用,合成微生物蛋白,所以尿素分解菌在尿素氮循环中发挥关键作用。基于体外培养和以gDNA为靶标的测序技术已经对瘤胃尿素分解菌群多样性进行了探究,但是,这些结果仅解决了瘤胃中存在哪些尿素分解菌的问题,而没有阐明正在发挥功能的活性尿素分解菌群及其多样性。本研究的目的是基于RNA测序揭示瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多样性。为了从瘤胃微生物中提取高质量的RNA,本研究对样品前处理方法进行了优化。试验共优化四个前处理条件:瘤胃液样品形式、样品保存形式、解冻处理和研磨温度,组合形成五个处理组:(1)微生物菌体加RNA保护液液氮冷冻研磨、(2)微生物菌体液氮保存液氮冷冻研磨、(3)微生物菌体液氮保存常温研磨、(4)瘤胃内容物液氮保存液氮冷冻研磨、(5)瘤胃内容物液氮保存解冻收集菌体液氮冷冻研磨。每组设置3个重复,检测RNA浓度和完整度(RIN)。结果表明,瘤胃液样品形式对RNA浓度和RIN差异不显著;液氮保存的样品提取的RNA浓度和RIN均显著高于RNA保护液保存的样品;解冻处理对RNA浓度差异不显著,但是会降低RIN;研磨温度对RIN没有显著差异,但是冷冻研磨提取的RNA浓度显著高于常温研磨。为了分析瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多样性,在晨饲后0,2和6 h,采集4头干奶期瘘管荷斯坦奶牛瘤胃液,提取瘤胃液DNA和RNA,去除RNA中gDNA污染,得到纯净的RNA反转录为cDNA。利用ureC引物对DNA和cDNA进行PCR扩增并测序,利用QIIME软件进行序列质量控制、物种注释、OTU分型以及多样性分析。结果表明,DNA序列中约50%ureC基因无法在门水平注释到已有物种,cDNA中这一数值为43%,表明瘤胃中栖息着大量新的、未知尿素分解菌。采样时间对DNA和cDNA ureC基因的α和β多样性无显著差异。cDNA中ureC基因Shannon指数大于DNA(P<0.05)。cDNA与DNA UreC基因的β多样性有显著性差异(P<0.01)。瘤胃中高活性的尿素分解菌在属水平上主要分布在幽门螺杆菌属(Helicobacter)、草螺菌属(Herbaspirillum)、梭菌属(clostridium)、芽孢杆菌属(Paenibacillus)、聚球藻菌属(Synechococcus)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)。从ureC基因OTUs的变化可以看出,DNA和cDNA之间高丰度的尿素分解菌是相似的,差异主要发生在低丰度的菌属。本研究建立了提取高质量瘤胃微生物RNA的前处理方法,揭示了瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多样性特征,为调控瘤胃尿素氮利用效率提供了理论依据。