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雷公藤红素（celastrol）是从中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）中提取的活性成分，具有广泛的药理作用，有望被开发成治疗慢性炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症的新药。当前集中某一通路的研究模式虽然发现了雷公藤红素影响了体内多种信号通路，然而对其缺乏整体的系统性研究，其药靶和确切的作用机制尚不明确。此外，由于其结构不稳定、溶解性差、生物利用度差等问题，限制了其临床应用前景，有必要对其进行相应地结构改造，以期得到增效减毒的结构改造物。本课题利用基于气相色谱-质谱联用技术的细胞代谢组学系统研究了雷公藤红素及其结构改造物NST-001抗人子宫颈癌细胞的药理效应和作用机制，并对相关的药理作用机制理论提出了细胞代谢层面的解释。探寻和确立药物作用的靶点是新药研究中最为关键的一步，本课题利用新颖的药物靶点筛选模式“基于药物亲和的靶点稳定性筛选技术”（DrugAffinity Responsive Target Stability，DARTS）和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）筛选得到了NST-001的潜在靶点——脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，FAS），并通过分子对接技术构建了雷公藤红素及NST-001与脂肪酸合成酶的对接模拟，间接地验证了脂肪酸合成酶为NST-001的靶点。一、细胞凋亡检测及基于GC-MS技术的细胞代谢组学研究雷公藤红素抗癌机制首先通过生物学技术手段证明了雷公藤红素呈现剂量依赖性抑制HeLa细胞增殖并诱导其发生凋亡，能够激活HeLa细胞的caspase-3活性，降低细胞线粒体膜电位。选择三种药理机制明确的细胞毒性药物顺铂、多柔比星、紫杉醇作为阳性药物，利用基于GC-MS的细胞代谢组学，多通路全方面监控HeLa细胞经雷公藤红素处理后代谢特征谱的变化规律。最终结果显示，HeLa细胞三羧酸循环水平下降，糖酵解上升，能量代谢减缓，氨基酸代谢、蛋白质合成、核酸代谢相应地受到阻滞，显示出HeLa细胞处于凋亡的非正常生理状态。本研究为雷公藤红素的半胱氨酸迈克尔加成反应作用机制假说提供了代谢组学层面的佐证。二、细胞凋亡检测及细胞代谢组学研究雷公藤红素类似物NST-001抗癌机制首先通过生物学技术手段证明了NST-001保持了雷公藤红素相似的抗癌活性，能以剂量依赖性抑制HeLa细胞增殖并诱导其发生凋亡，并将HeLa细胞周期阻滞在G2期，能够激活HeLa细胞的caspase-3、caspase-9活性，降低细胞线粒体膜电位，上调促凋亡因子Bax的表达，下调抑凋亡因子Bcl-2的表达。此后，利用前期建立好的细胞代谢组学方法系统地研究了NST-001的抗癌机制，结果显示，经NST-001处理后，HeLa细胞三羧酸循环水平下降，糖酵解上升，能量代谢减缓，氨基酸代谢、蛋白质合成、核酸代谢相应地受到阻滞，反映出HeLa细胞处于凋亡的非正常生理状态。三、基于DARTS和MALDI-TOF/TOF MS联用的NST-001药靶研究药物靶点的筛选和确证是新药研究中的重点和难点，阐明了分子靶点可以清晰彻底地阐明药物的药理活性和作用机制。虽然关于雷公藤红素的大量研究揭示了雷公藤红素参与和调节了体内各种信号通路，然而其直接的作用靶点尚未见报道。本课题通过DARTS药靶筛选方法筛选NST-001直接靶点，并通过MALDI-TOF/TOFMS进行了鉴定，得到了NST-001的潜在靶点FAS。FAS在多种类型的癌细胞中都处于高表达水平，以FAS为药靶开发FAS抑制剂可以用作抗癌、抗肥胖药物。美国FDA批准的FAS抑制剂奥利司他（Orlistat）可以通过与FAS中得硫脂酶功能区域（TE）发生作用来发挥其抗癌活性作用。因此利用分子对接技术将雷公藤红素及NST-001与FAS中的TE功能区域进行模拟对接，结果显示，NST-001与雷公藤红素相比，与TE功能区域作用力更强，提示NST-001可能是比雷公藤红素更好的FAS抑制剂。本课题研究借鉴系统生物学研究策略，综合运用生物技术和质谱技术系统研究中药活性单体药理活性和作用机制，为研究中药活性单体提供了重要的方法参考。本课题研究建立了一套准确耐用、快速便捷基于GC-MS的细胞代谢组学方法；并利用确证的细胞代谢组学方法系统评价了雷公藤红素及其结构改造物NST-001的抗癌活性，为雷公藤红素与半胱氨酸发生迈克尔加成反应的作用机制假说提出了代谢组层面的佐证；同时利用DARTS与MALDI-TOF/TOF MS联用技术筛选得到了NST-001潜在靶点FAS，并通过分子对接技术进行了验证。