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目的:胃癌是常见恶性肿瘤之一,发病率和死亡率非常高。虽然近年来,我国在胃癌的诊断及治疗上已经取得了巨大的进步,但大多数患者在确诊时已处于晚期阶段,失去了行根治性手术的机会,即便进行了手术,甚至术后的辅助放化疗、靶向及生物治疗等,患者的复发率及转移风险仍很高,进展期胃癌患者的5年生存率仅为30%-50%,很可能是因为胃癌具有极强分子异质性。研究发现,上皮向间质转化(EMT)激活,是胃癌侵袭转移重要机制之一。研究提示,自噬(autophagy)与癌细胞EMT及侵袭密切相关,且到相关分子的调控。课题组前期利用Human LncRNA Microarray建立胃癌相关lncRNAs表达谱,发现lncRNA AK022914在胃癌中高表达,但是其在胃癌中作用及分子机制尚不清楚。方法:1.选择5个有明确胃癌家族史的胃癌患者,采用高通量lncRNA芯片系统性地检测组织中胃癌组织及其配对的癌旁组织中lncRNAs的表达情况;从中选择高表达的lncRNA AK022914进行研究。2.首先采用荧光实时定量PCR方法检测120对胃癌及其癌旁配对正常组织中AK022914、自噬相关分子LC3B、Atg7基因mRNA水平,并分析AK022914与患者年龄、性别、发病部位、分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、幽门螺杆菌感染、患者五年生存期及自噬相关分子LC3B、Atg7基因相关性。3.采用定量PCR方法检测正常胃GES1细胞株及常见胃癌细胞株,了解AK022914在细胞株中表达情况,并选择了AGS及BGC823作为后续细胞研究对象。4.分别构建AK022914过表达慢病毒载体及小干扰RNA,通过脂质体转染法处理AGC及BGC823细胞株,观察下调或上调对癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及EMT相关分子E-cadherin及N-cadhein的影响;并利用裸鼠模型,观察AK022914过表达对癌细胞成瘤及E-cadherin及N-cadherin蛋白的影响。5.为了解AK022914诱导EMT及促进侵袭的分子机制,基于自噬角度,从临床标本、细胞水平、裸鼠水平,探讨了AK022914诱导EMT及促进侵袭的分子机制。结果:1.LncRNA芯片检测发现,AK022914在胃癌组织中高表达。2.采用实时荧光定量PCR的方法检测在120对胃癌及其配对正常组织中的AK022914 mRNA的表达水平。按照AK022914表达高低,将标本分为两组,每组各60对。结果发现,AK022914与肿瘤浸润(p=0.000)、淋巴结转移(p=0.001)、远处转移(p=0.001)、TNM分期(p=0.000)及5年生存期明显相关(p=0.000),而与患者性别(p=0.853)、年龄(p=0.350)、肿瘤直径(p=0.10)、肿瘤部位(p=0.924)、肿瘤分化程度(p=0.077)无明显相关。进一步研究发现,AK022914与自噬相关分子LC3B、Atg7表达呈正相关。3.细胞株中检测发现,与正常胃GES-细胞株1比较,AK022914在不同胃癌细胞系中均呈不程度地增高。后续研究采用AGS和BGC823为细胞研究模型。4.通过分子敲低试验处理胃癌AGS、BGC823细胞,分别采用CCK8、克隆形成试验、划痕修复试验、Transwell方法检测癌细胞增殖、迁移、侵袭能力,结果发现,与空白对照组及空载对照组(Emepty Vector,EV)比较,过表达组癌细胞增殖、克隆数、细胞迁移、侵袭能力明显上升,差异均具有统计学意义;此外还发现,在高表达目的lncRNA细胞中,E-cadherin蛋白下降,而N-cadherin蛋白上升;而siRNA组呈现相反现象:与空白对照组及EV组比较,AK022914 siRNA组癌细胞增殖、克隆数、细胞迁移、侵袭能力明显下降,均具有统计学意义;且EMT相关蛋白E-cadherin蛋白上升,而N-cadherin蛋白下降。通过体内研究进一步发现,AK022914过表达组裸鼠模型肿瘤增长速度、体积及质量均明显高于对照组裸鼠。此外,与对照组比较,AK022914过表达小鼠组E-cadherin蛋白下降,而N-cadherin蛋白上升,提示AK022914过表达促进胃癌细胞EMT。5.临床标本研究发现,胃癌组织中,EMT相关分子E-cadherin与自噬相关基因LC3B、Atg7呈负相关(r=-0.888,r=-0.788),N-cadherin与自噬相关基因LC3B、Atg7表达呈正相关(r=0.964,r=0.946)。裸鼠模型研究发现,与EV组比较,AK022914过表达组LC3B和Atg7蛋白表达升高。体外细胞学显示:与EV组比较,AK022914过表达组细胞自噬相关基因LC3荧光斑块增加,红色荧光斑点增加,自噬相关基因Atg7表达增加;而siRNA组细胞LC3荧光斑块减少,红色荧光斑点减少,自噬相关基因Atg7表达降低。临床水平、裸鼠模型及细胞学结果提示,AK022914过表达与胃癌细胞EMT及自噬密切相关。6.进一步在胃癌AGS细胞株中进行了AK022914质粒与Atg7 si RNA共转染,使AK022914过表达且干扰自噬基因Atg7的表达。Western blot检测发现,共转染AK022914+siAtg7后较单纯AK022914过表达组细胞E-cadherin增高,但N-cadherin降低EMT降低,但总体仍比空白对照组增高。由此提示,AK022914通过自噬促进胃癌细胞EMT。结论:1.LncRNA AK022914在胃癌中高表达,可能是重要的胃癌不良预后因子;2.诱导EMT,可能是AK022914发挥促癌作用重要机制之一;3.AK022914可能通过自噬途径调控胃癌细胞EMT。