乌苏里貉(Nyctereutes procyonoides)是珍贵的犬科毛皮动物之一,在长期饲养管理过程中,野生型乌苏里貉被毛为棕褐色,它先后突变产生白貉、黑貉、红棕貉,白貉养殖量较少,黑貉和红棕貉的数量逐年增多,但被毛颜色变化机制并不完全清楚。为了解乌苏里貉毛色差异产生的原因,本研究选取相同胎次4月龄的四种毛色乌苏里貉各24只,采集静脉血测定酪氨酸酶活性,选取同父同母相同胎次的四种毛色乌苏里貉各3只,收集被毛显微观察黑色素分布,并分别测定针毛和绒毛的真黑色素和总黑色素含量,同时采集被毛下的皮肤进行转录组测序,分析转录本结构并作差异表达分析,注释出与黑色素生成相关的显著差异表达基因,并进行荧光定量PCR验证,最后,使用基于机器学习和人工神经网络等在线软件对KIT基因及其编码蛋白一级、二级、三级结构作全面生物信息学分析。研究结果如下:(1)通过对白貉、黑貉、红棕貉、野生貉的针毛和绒毛进行显微观察发现,白貉绒毛中存在的黑色颗粒最少,红棕貉针毛的黑色颗粒在毛皮质和毛髓质中形成致密的黑色区域,野生貉针毛的黑色区域占比更多,黑貉中黑色区域占据整个毛干。使用分光光度法对四种毛色乌苏里貉的被毛中总黑色素含量定量分析发现,白貉、红棕貉、野生貉和黑貉被毛中总黑色素含量依次增多,野生貉的总黑色素和真黑色素含量极显著高于白貉和红棕貉(P<0.01),极显著低于黑貉(P<0.01),被毛总黑色素含量测定结果与显微观察的结果大体一致。通过血液酪氨酸酶活性测定结果发现,黑貉、野生貉的酪氨酸酶活性极显著高于白貉(P<0.01),红棕貉的酪氨酸酶活性显著高于白貉(P<0.05),但黑貉、野生貉、红棕貉之间的酪氨酸酶活性差异并不显著。(2)利用Illumina Hiseq2000高通量测序平台对四种毛色乌苏里貉皮肤作转录组测序,12个样本共产生约35Gb的Clean Data,从白貉、红棕貉、黑貉和野生貉的皮肤中分别得到155,222个Unigene、155,928个Unigene、122,710个Unigene和155,457个Unigene。所有的Unigene分别注释到NR、Swiss-prot、Nt、GO、COG和KEGG数据库中,其中共有108,988个Unigene被注释,共有64,387个编码蛋白框(CDS),其中比对到蛋白库的CDS有61,845个,但仅预测出2,542个CDS。共存在41,522个微卫星位点。单核苷酸多态性分析显示碱基转换的数量多于颠换的数量。使用R语言的DESeq2包分析乌苏里貉皮肤转录组的差异表达基因(|log2(foldchange)|>1,FDR≤0.05)。结果表明,黑貉相对于野生貉共有27个差异表达基因,其中19个上调,8个下调;红棕貉相对于野生貉共有11个差异表达基因,其中8个上调,3个下调;红棕貉相对于白貉共有443个差异表达基因,其中298个上调,145个下调。通过GO和KEGG分析发现,野生貉和黑貉的差异表达基因中与黑色素生成相关的基因为Loc101179511、MRPL54、BAHD1,可能是差异表达基因增加肌动蛋白的合成,促进黑素小体的转运,使得黑貉被毛黑色素含量多比野生型乌苏里貉;野生貉和红棕貉的差异表达基因中与黑色素生成相关的基因为LOC482436、IGFBP6,可能是差异表达基因影响氨基酸代谢和降解,进而影响黑色素生成过程的某些酶的合成,从而使红貉的黑色素合成减少;白貉和红棕貉之间的差异表达基因中与黑色素生成相关的基因有22个,其中TYR和TYRP1直接影响黑色素生成含量,MCIR可能影响黑色素生成的类型。随机选取7个基因做q RT-PCR验证,结果与转录本测序一致。(3)乌苏里貉KIT基因全长2,919bp,编码972个氨基酸,属于酸性亲水型蛋白,无规则卷曲为主要二级结构,存在两个跨膜区,细胞膜外侧存在信号肽,含有21个糖基位点,60个磷酸化位点,4个保守结构域,与5个蛋白密切作用,系统发育树构建结与生物学分类一致。分析结果为进一步研究乌苏里貉KIT蛋白生物学特性奠定基础。综上所述,黑貉和红棕貉毛色差异的产生与酪氨酸酶活性无关,而白貉被毛白化的主要原因是酪氨酸酶活性低。MC1R基因可能与乌苏里貉黑色素产生类型有关,TYR基因与乌苏里貉黑色素产生多少有关。乌苏里貉KIT基因及编码蛋白的结构具有物种特异性。