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酯类是中国白酒中风味物质含量最多的一类,是酒类的香味物质基础。酒类的不同多是由于酒体中风味物质的不同所决定。其中由于乙酸酯含量相对较多而且容易被检测对酒体风味影响最大,所以研究乙酸酯更有价值。本研究从弱化表达乙酸酯合成酶活力以及提高醇乙酰转移酶和辅酶Ⅰ的含量来调控乙酸酯的合成,通过截断PGK1启动子插入到ATF1基因前实现启动子调控基因表达水平,以及过表达CAB1/CAB3基因(泛酸激酶)达到提高辅酶Ⅰ含量进而提高乙酸酯含量的目的。研究内容如下:(1)以ATF1基因的5’端为靶位点、PGK1p作为目的片段,通过融合PCR技术建立了无缝连接的梯度过表达ATF1基因盒子。然后分别将梯度过表达盒子连接到整合质粒YIPlac211质粒上,利用质粒上的URA3筛选标记基因为两步同源重组提供正反筛选标记;通过两步同源重组的方法将线性化的重组质粒分别转入到白酒酵母菌AY12a,通过PCR验证筛选目的酿酒酵母突变菌株;在白酒酵母菌株中PGK1启动子3’端缺失100 bp、200bp、300bp的菌株ATF1基因表达量分别下降为未截断的菌株AY12a-P(ATF1基因前插入为全长的PGK1基因启动子)的20%,17%和10%;AY12a-P-100、AY12a-P-200和AY12a-P-300的醇乙酰转移酶活力相对于AY12a-P均有所降低,分别降低了 36%,56%和62%,相对于亲本菌株AY12a仍是提高的。对得到的白酒酵母工程菌株进行玉米浓醪结果显示,AY12a-P的乙酸乙酯含量提高到了54mg/l,相比较 AY12a-P 而言 AY12a-P-100、AY12a-P-200 和 AY12a-P-300 的乙酸乙酯含量分别降低28%、30%和42%。(2)将梯度过表达质粒通过两步同源重组整合到多配体啤酒酵母菌株中,得到的菌株通过菌株驯化实验实现发酵性恢复。突变株S6-P12和S6-P30的ATF1 mRNA水平和醇乙酰转移酶活力相对于亲本菌株S6均有所提高,分别提高了 4倍和3倍。对得到的工程啤酒酵母菌株分别进行麦芽汁啤酒发酵,结果显示重组菌株S6-P的乙酸乙酯含量(mg/l)有所提高,从原来亲本菌株的(mg/l)19.96提高到(mg/L)23.98～24.00,提高了 20%,乙酸异戊酯没有明显变化。此外,正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和苯乙醇分别下降了 8%、13%、6%、20%和10%。(3)在白酒酵母菌株中分别过表达CAB1和CAB3并且同时敲除BAP2基因,以探究该基因对酿酒酵母菌株的乙酸酯和高级醇合成的影响;在得到的工程菌株中AY12α-P乙酸乙酯的含量从24.82 mg/L提升到43.27mg/L,提高了 74.00%,同时乙酸异戊酯的含量也有小幅度提高,提高了 35.92%;突变株AY12α-AB2+UC1和AY12α-ΔB2+UC3乙酸乙酯的含量分别提高了 51%和42%,同时这两株突变株的乙酸异戊酯含量也有提升,分别增加了 39.97%和14.50%;正丙醇有降低幅度分别为26.67%和21.66%,其中AY12α-ΔB2+UC3的苯乙醇也有小幅度降低,降低了 8.29%。AY12α-P的NAD+和NADH含量分别增加到0.247nmol/mg和0.084nmol/mg,相比于原菌增加了 74%和 68%;AY12α-ΔB2+UC1 的 NAD 和 NADH 含量分别增加到 0.218nmol/mg和 0.117nmol/mg 相比于原菌增加了 54%和 134%;AY12α-ΔB2+UC3 的 NAD 和 NADH含量分别增加到0.449nmol/mg和0.085nmol/mg相比于原菌增加了 216%和70%。