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油菜素内酯(BRs)作为植物的第六大激素,在植物的生长和发育中起着重要作用。自70年代Mitchell等人从油菜中提取出油菜素内酯以来,关于油菜素内酯的合成和信号通路及其在农业中的应用均进行了广泛研究,但大部分的研究都集中在草本植物中,在木本植物巾的研究几乎没有报道。草本植物和木本植物的最大区别就是木本植物比草本植物具有更丰富的次生生长。为了研究油菜素内酯在木本植物次生生长中的生物学功能,我们从杨树测序品种毛果杨(Populous trichocarpa)中克隆了拟南芥油菜素内酯受体BRI1(Brassinosteroid-Insensitive1)的同源基因PtBRI1.2。将该基因的过表达载体通过农杆菌介导法导入栽培品种山新杨(P.davidiana×P.bolleana)中,并对转基因植株进行了GUS组织化学染色、PCR、qRT-PCR和Western等分子检测及细胞组织化学检测。我们发现适量表达PtBRI1.2的转基因株系L9、L10、L14在组培苗时期、温室苗时期以及田间试验中的生长速度均显著加快,表现为直径变粗和株高变高。进一步分析发现其株高变高主要是由杨树节间距和节间数目变多引起的;直径变粗是由于木质部增多,但次生细胞壁的厚度没有明显的变化。同时,转基因株系木质部中的长纤维增多,短纤维变少。荧光免疫组织化学分析表明BR信号途径关键转录因子BZR1(brassinazole-resistant1)在分化中的木质部中高表达,在成熟木质部中表达量较低;转基因杨树中BZR1保持较高的活性。双荧光实验表明BZR1可以调控杨树木质发育关键NAC转录因子基因WNDs的表达;酵母单杂和EMSA实验表明BZR1可以直接调控Pt WND4B启动。而且转基因杨树木质部中WNDs和纤维素、木质素合成基因的表达都明显上调。以上结果表明,适量表达PtBRI1.2可以激活BR信号途径,使BZR1转录因子保持高的活性来诱导WNDs的表达从而激活下游纤维素、木质素等次生细胞壁合成相关基因的表达进而促进转基因杨树木质部的发育。 另外,qRT-PCR和Western检测发现转基因株系L2、L4、L5和L15中PtBRI1.2转录和蛋白水平都高度过量表达。一个月左右的转基因株系组培苗节间生长明显增快;温室中生长一个月的转基因株系叶片由上往下开始慢慢向内卷曲。扫描电镜实验发现,转基因叶片上表皮细胞数目增多,下表皮细胞数目增多并发生堆叠。石蜡切片表明,转基因株系的叶片栅栏组织和海绵组织细胞变小。表明BR在调控叶片发育中也起重要作用,但是具体的调控机制尚未研究清楚。 由此可见,杨树油菜素内酯受体PtBRI1.2在低水平过表达是可以促进植株的生长,高水平过表达时影响叶片的发育。