背景：肝癌是目前常见的恶性肿瘤,我国肝癌死亡率占肿瘤死亡率居高不下。肝癌分原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)、胆管细胞癌(cholangio carcinoma ICC)和混合细胞癌。肝癌治疗方法首选是手术切除即是肝部分切除术。中国肝癌大多数是由于肝炎、肝硬化导致,所以大部分肝癌因患者肿瘤自身条件不能手术。很多肝癌患者行肝癌根治性切除后肝内复发,目前尚没有较好预测复发的检测,复发可能与肝癌患者本身生物遗传物质改变有关。肝癌根治性切除术后复发率在第一年内较高,而且复发患者的预后也较其他晚期复发的患者差。因此肝癌术后是否早期复发成为了影响患者预后的重要原因。找出影响肝癌早期复发发生的关键信号通路及靶基因,并采取有效措施,提高肝癌根治性的可切除术率和疗效。我们的前期研究工作建立起了符合基因组学研究的较完善的肝癌数据标本库,并利用AffymetrixU133plus2.0芯片在全基因组范围内比较了10例术后1年内复发及10例术后超过2年未复发的两组肝癌患者基因表达谱的差异,发现了一批与肝癌早期复发相关的敏感基因。具有重要意义的是发现盘状结构域受体酪氨酸激酶(discoidin domain receptor tyrosine kinase1, DDR1)基因；在早期复发组,均明显上调,提示DDRl基因显著上调与肝癌的早期复发密切相关。进一步的RT-PCR及western-blot实验也证实DDR1基因在早期复发患者肝癌组织中表达量明显高于非早期复发患者,DDRl基因高表达与肝癌的高侵袭性密切相关。这高度提示,DDR1基因有可能成为肝癌基因治疗的一个新的敏感分子靶标。前期研究者又利用miRNA芯片(Agilent)技术比较了术后1年内复发及术后超过2年未复发的两组肝癌患者在全基因组范围miRNA表达谱的差异,发现与肝癌早期复发转移相关的一些差异表达的MicroRNA,其中miR-96通过生物信息学技术预测可能与DDR1基因表达密切相关,及miRNA芯片技术筛选肝癌早期复发密切相关的miRNA,发表《利用芯片技术筛选肝癌早期复发密切相关的microRNA》[4],其中发现miR-96是其中一个表达明显下调的miRNA。既往研究中,miR-96在胰腺癌中可作为肿瘤抑制性miRNA直接靶向KRAS基因,在临床标本中,miR-96表达下调或消失,而KRAS却表达上调,体外研究显示miR-96通过KRAS下调相关的方式降低癌细胞侵袭和迁移,其他研究还发现miR-96在乳腺癌、前列腺癌发生发展中起负性调控作用。前期研究利用基因芯片技术在全基因组范围内检测了早期复发组和非早期复发组肝癌并且比较其基因表达谱的差异,筛选了与肝癌早期复发相关的敏感基因,研究发现了一批在早期复发组较非早期复发组中表达上调及下调的基因,这些差异表达基因主要为细胞黏附运动相关基因、细胞代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞凋亡周期相关基因等等。其中肿瘤相关钙离子信号转导蛋白1(TACSTD1)基因属于其中的细胞粘附运动相关基因,是一种癌相关抗原,在内皮细胞和胃肠道肿瘤中表达,与细胞黏附作用相关。近年相关研究发现可以作为免疫治疗的靶分子,在其他肿瘤如食管癌、宫颈癌均证实TACSTD1在其癌组织中高表达。目的：运用实时荧光定量PCR技术和免疫组化技术在大样品的基础上验证miR-96和TACSTD1在原发性肝细胞癌根治术后早期复发组与非早期复发组肝癌之间表达水平的差异,从而探讨miR-96和TACSTD1的表达与肝细胞癌根治术后早期复发关系。方法：根据筛选标准,早期复发定义为复发时间自肝癌根治术后至肿瘤复发在-年以内,非早期复发定义为自肝癌根治术后2年以上未见复发,从广东省人民医院肝胆外科行肝癌根治术的病例中筛选出61例,标本组织均为深低温冻存的。其中肝癌术后早期复发组为33例(根治术后1年内出现肝内复发病灶),28例为非早期复发组(术后超过2年未出现肝内复发病灶)。收集61例病例的一般临床资料及肿瘤资料包括性别、年龄、肿瘤直径、有无脉管癌栓、有无肝内转移、有无门脉癌栓、病理分级等。分别采用实时荧光定量PCR验证miR-96及免疫组化技术验证TACSTD1在两组肝细胞癌组织的表达水平。采用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±S)表示,采用两独立样本t检验,方差不齐者采用非参检验；计数资料采用卡方检验,理论频数小于5者采用连续性校正卡方检验；P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、早期复发组与非早期复发组肝癌一般临床资料的比较肝癌根治术后早期复发组与非早期复发组中一般临床资料中肿瘤直径的差异(P<0.001)有统计学意义；在此次研究中提示肿瘤直径可能是肝癌根治术后早期复发密切相关的一个因素,而其他如年龄、性别、脉管癌栓、是否肝内转移、病理分级高低、门脉癌栓等因素与早期复发是否有关系尚待进一步研究。2、实时荧光定量PCR检测miR-96在肝癌细胞中的表达实时荧光定量PCR检测miR-96在61例肝癌组织中的表达水平结果显示,相对于非早期复发组肝癌组织,miR-96在早期复发组肝癌组织中表达明显下调[(0.634±0.783)VS(5.182±11.321),P=0.016],下调达8.174倍,两组比较在统计学上差异有统计学意义。3、miR-96在肝癌中的表达量与临床病理特征的关系根据miR-96在肝癌组织中的相对表达量数值的中位数为界,将61例肝癌病例组分为高表达组和低表达组,运用统计分析显示,miR-96在肝癌中的表达量与肿瘤直径的大小(X2=4.761,P=0.029)、肝癌术后早期复发(X2=4.867,P=0.027)有关,有统计学差异,与其余特征无统计学差异。4、免疫组化法检测TACSTD1在肝癌细胞中的表达TACSTD1在阳性对照(食管癌组织)染色定位为细胞膜,呈棕黄色染色,在正常肝组织中呈阴性表达,在本实验中阳性染色定位于细胞膜：61例肝癌组织中表达总阳性率为8.2%(5/61),其中在早期复发组中阳性表达率为9.09%(3/33),非早期复发组中阳性表达率为7.14%(2/28)；TACSTD1在早期复发组和非早期复发组表达差异无统计学意义(P=0.999)。结论：1、肿瘤直径大小是肝癌根治术后早期复发密切相关的一个因素,而其他如年龄、性别、脉管癌栓、是否肝内转移、病理分级高低、门脉癌栓等因素与早期复发是否有关系尚待进一步研究；2、miR-96在早期复发组肝癌中的表达远低于非早期复发组,与肝癌术后早期复发有密切关系,且miR-96在肝癌中的表达量与肿瘤直径的大小、肝癌术后早期复发有关,miR-96有可能成为肝癌根治术后预测肝癌复发的分子标志物；3、TACSTD1与肝癌根治术后早期复发的关系尚不能确定,有待进一步研究。