研究背景心肌梗死是世界范围内致死致残的主要原因之一。全世界约三分之一的心衰患者是由它导致的,尽管现在已经有了很多治疗措施。实际上,一支主要的冠状动脉的堵塞可以致使心肌的严重缺血和心肌细胞的快速凋亡,进而导致进行性的纤维化代替心肌组织和左心室的扩张。进展性的左心室重构可以导致心肌梗死后心衰,而心衰患者的预后目前情况依然不容乐观。因此,目前以促进新生血管来增加缺血组织灌注的方法,成为治疗缺血性心脏疾病的新的希望。通心络是一种中国传统的中药复方制剂,早在1996年被中国国家食品药品监督管理总局批准用于心绞痛和缺血性脑卒中的治疗。越来越多的证据表明,传统中药通心络具有心脏保护作用。通心络对于降低血清脂质含量、抑制斑块炎症和增强易损斑块的稳定性方面,具有良好的疗效。它还可以用来治疗心肌缺血无复流和缺血再灌注损伤,并可以改善血管内皮功能,然而,我们并不清楚通心络在心肌梗死后对心脏功能和心脏重构方面是否有作用。因此,我们设计了这个实验来研究通心络对心肌梗死后小鼠的心脏功能和心脏重构情况的影响,及其作用机制。研究目的：1.建立小鼠心肌梗死模型,观察通心络对心肌梗死导致缺血后心脏功能和心室重构的影响。2.阐明通心络对心肌梗死保护效果的可能的作用机制。研究方法：1.动物分组C57BL/6背景小鼠(10周龄,雄性),随机分为5组。(1)假手术组；(2)心肌梗死模型组,只用生理盐水溶液灌胃(10mL/kg/day);(3)通心络低剂量治疗组,通心络灌胃量为0.38克/千克体重/天；(4)通心络中剂量治疗组,通心络灌胃量为0.75克/千克体重/天；(5)通心络高剂量治疗组,通心络灌胃量为1.5克/千克体重/天。术前预喂药1周,术后持续灌胃30天,分别在术后第7天处死各组实验小鼠10只～15只,30天末处死剩余全部小鼠。2.小鼠心肌梗死模型的建立使用异氟烷麻醉小鼠并给予维持,建立呼吸支持,模型组与治疗组均行冠状动脉左前降支结扎术。颈部及左前胸脱毛,剪开颈部皮肤,行气管插管。建立有效呼吸支持后,开胸,剪开心包,暴露冠状动脉左前降支。用7-0的无损缝合线进行冠状动脉结扎,结扎成功后,左心室前壁会变苍白并且运动异常,逐层关胸。假手术组只开胸穿线,不结扎冠状动脉,手术时间与其他组匹配。3.超声分析术后30天时,将异氟烷麻醉的小鼠进行经胸超声心动图检测,用来评估左心室功能。选取频率为35MHz的712型超声探头进行的心脏大小和功能参数的采集,用高分辨率超声Vevo770系统进行数据分析。探头放置于小鼠左前胸,在心脏乳头肌水平进行M型超声检测,测量舒张末期左心室内径(LVIDd)、收缩末期左室内径(LVIDs)。系统自动算出射血分数、短轴缩短率。4.组织学分析术后7天、30天,处死相应小鼠,使用小鼠左心室石蜡切片进行组织学分析。在相应时间点麻醉后,开胸,剪开右心耳,进行生理盐水灌注,注射少量10%氯化钾使之停搏在舒张期,待血液冲洗干净,进行甲醛灌注固定、组织脱水、浸蜡切片。制备5μm石蜡于HE染色、Masson三色染色及免疫组化(荧光)染色。使用HE染色切片计算左心室梗死百分比；使用Masson染色进行测量梗死周边区间质纤维化；使用免疫组化检测相关指标的阳性率。分析使用IPP图像处理软件。5.凋亡检测使用原位细胞凋亡检测试剂盒检测梗死周边区心肌细胞的凋亡率,整个核完全被染色的心肌细胞被认为是凋亡细胞。6.毛细血管密度使用CD31(PECAM-1)作为血管内皮标志物,检测围梗死区毛细血管密度。7.蛋白表达水平检测(Western Blot)术后7天,提取梗死心脏周边区的组织进行蛋白表达水平的检测。提取蛋白、测定蛋白浓度、凝胶电泳、转膜、孵育一抗及二抗最后用化学发光显色。用IPP软件进行表达量分析。8.凝胶电泳迁移分析(EMSA)使用凝胶电泳迁移分析(EMSA)化学发光检测试剂盒检测缺氧诱导因子1a活性。提取围梗死区心脏组织核蛋白,电泳,交联,封闭,化学发光检测。9.数据分析数据以均数±标准误表示。用SPSS18.0软件做统计分析。组间比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析方法,检验方差齐性,若数据方差齐,使用LSD检验；若数据方差不齐,使用Dunnett’s T3检验。P<0.05被认为有统计学意义。研究结果1.一般情况及生存率分析假手术组小鼠术后无死亡,一般情况良好。通心络干预减少了实验性心肌梗死小鼠的死亡率。2.心脏超声检测术后30天检测左心室功能参数,通心络治疗改善了心肌梗死后心脏功能参数。3.梗死大小H&E染色显示,应用通心络治疗后,梗死百分比显著减小。4.心肌间质纤维化使用Masson染色检测梗死周边区的纤维化程度。应用通心络后,可以显著减少心梗引起的纤维化情况。5. TUNEL染色经过通心络干预后,心肌梗死引发的凋亡情况显著改善。6.毛细血管密度与模型组相比较,通心络各组表现出更高的毛细血管密度。7. Western blot通心络治疗可以增加P13K、磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化eNOS和血管生长因子的表达。8. EMSA通心络治疗增加了缺氧诱导因子1α的DNA结合活性。结论：1.通心络具有改善心肌梗死小鼠后心脏功能和减弱心室重构的作用。2.通心络可以增加心肌梗死周边区的微血管密度、减小心室梗死百分比、减轻心肌间质纤维化程度。3.通心络可以激活血管生成通路的重要因子PI3K/AKT、ERK、HIF-1α、VEGF及p-eNOS,说明通心络的心脏保护作用可能是通过激活血管生成信号通路而完成的。研究背景：心肌梗死(MI)是冠状动脉闭塞,流向心脏的血流受阻的一种典型的缺血性心脏病。2013年世界卫生组织的世界卫生统计报告表明,缺血性心脏疾病呈上升趋势,仍然是全球死亡的最常见原因,构成约所有死亡人数的14%。心肌梗死的情况下血管生成受损,受损的血管生成可以导致血管闭塞的血流恢复不完全,并且导致组织缺血,心肌缺血引起心肌细胞的死亡,恶性的心室重构和心室功能不全,其严重程度是决定预后情况的重要因素。组织的新生血管是对血管闭塞性疾病的非常重要的适应性反应。越来越多的证据表明,后天的组织血管生成不仅依靠从原来存在的内皮中“出芽”式生长,骨髓来源的循环中的内皮祖细胞(EPCs)对血管生成的作用也非常的重要。内皮祖细胞可以归巢到缺血组织中,促进血管生成。心肌梗死后,数量不足的内皮祖细胞不足以完成足够的血管生成,进而使得心肌梗死的情况更加恶化。基础实验和临床实验表明,增强EPCs的动员,使用EPCs治疗急性心肌梗死可以减少心肌梗死大小,改善心脏功能。基质细胞衍生因子-1α/趋化因子受体4(SDF-1a/CXCR4)系统在心肌梗死后,祖细胞/动员和招募过程中,起到了非常重要的作用。在骨髓来源的干细胞,包括内皮祖细胞,都表达CXCR4,可以趋化运动到心脏组织中,促进心肌梗死后的血管生成。在我们第一部分实验的基础上,我们已经证明了通心络治疗可以改善心肌梗死后的心脏功能,增加其血管生成。但是,在心肌梗死的情况下,通心络对EPCs的影响仍不清楚。为此,提出本实验的假说,通心络可以通过激活SDF-1α/CXCR4系统,调节心肌梗死后EPCs的动员,改善EPCs的成管功能,改善心肌梗死。研究目的：1.体内实验观察通心络对心肌梗死后外周血内皮祖细胞的动员情况；2.体内实验观察通心络对SDF-la在缺血心脏中的表达情况；3.体外实验观察通心络对骨髓来源内皮祖细胞的成管功能的影响；4.探索通心络增强骨髓来源内皮祖细胞的成管功能的机制。研究方法：1.动物分组：雄性10周龄～12周龄,C57BL/6背景小鼠,随机分为5组：假手术组、心肌梗死模型组、通心络低剂量组、通心络中剂量组、通心络高剂量组。2.建立心肌梗死模型：异氟烷维持麻醉小鼠,建立呼吸支持,模型组与治疗组均行进行冠状动脉左前降支结扎术。颈部及左前胸脱毛,剪开颈部皮肤,行气管插管。建立有效呼吸支持后,开胸,剪开心包,暴露冠状动脉左前降支。用7-0的无损缝合线进行冠状动脉结扎,结扎成功后,左心室前壁会变苍白并且运动异常,逐层关胸。假手术组只开胸穿线,不结扎冠状动脉,手术时间与其他组匹配。3.流式细胞仪检测外周血EPCs的含量取心肌梗死后3天的小鼠外周血。分离外周血单核细胞,室温下孵育FITC标记的CD34抗体和APC标记的KDR抗体90分钟。然后PBS冲洗两次。上机待检。双阳性的细胞被认为是EPCs。4.EPCs的分离、培养、鉴定无菌条件下,使用EGM-2将小鼠下肢骨骨髓腔内的骨髓冲出,继而使用红细胞裂解液进行裂解,离心,重悬。使用EGM-2诱导培养为原代EPCs。将诱导培养7天的细胞,使用DiL-acLDL摄入实验染色与FITC-UEA-1-lectin染料荧光双染,将两者皆为阳性的细胞,鉴定为内皮祖细胞。5.MTT检测使用浓度为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、2000μg/mL的通心络刺激培养7天的EPCs,48小时后收集EPCs检测其细胞活力。6.最佳作用浓度的筛选使用无血清培养基对内皮祖细胞培养12小时后,分别以含通心络0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的终浓度的EGM-2加入含有EPCs的培养孔中,24小时后收集提取各孔细胞,待后续检测CXCR4的表达量。7.最佳作用时间的筛选使用无血清培养基对内皮祖细胞培养12小时后,以含200μg/mL通心络的EGM-2分别作用EPCs Oh.6h.12h.18h.24h.36h提取各孔细胞,待后续CXCR4表达量的检测。8.体外成管实验检测分为对照组、通心络组,通心络+AMD3100组。将BD基质胶在4℃条件下过夜融化,第二天铺板,预冷的吸头吸取50μL基质胶到96孔板中,37℃孵箱中孵育30分钟,待其成胶。将经历不同的刺激之后的各组EPCs,取50μL含104EPCs的EGM-2铺到胶上。8小时后,观察计算管腔形成程度。9.免疫组化分析取术后3天小鼠左心室组织,4%的多聚甲醛固定24小时,石蜡包埋,制备5μm切片行免疫组化分析。脱蜡、抗原修复、H202清除内源性过氧化物酶、血清封闭、4℃过夜孵育SDF-1a抗体、37℃孵育二抗30分钟、DAB显色、苏木素染核。10. RT-PCR提取术后3天梗死心脏周边区的组织及相应刺激后的EPCs细胞RNA、逆转录、RT-PCR检测CXCR4和GAPDH转录水平。目的基因的相对表达量使用2-△△ct的计算方法。11.数据统计分析方法数据使用均数士标准误表示,应用SPSS18.0,采用单因素方差分析(One Way ANOVA)比较组间数据。P<0.05为有统计学差异。实验结果：1.通心络上调了外周血中的EPCs的含量假手术组的外周血EPCs含量较少,心肌梗死模型组中的EPCs含量显著增多,与模型组相比较,通心络组进一步上调了外周血EPCs含量。2.免疫组化结果通心络增加了心脏SDF-la的表达。与假手术组相比较,模型组SDF-la表达有所增加。通心络干预增加了心肌组织的SDF-la表达量。3.骨髓来源EPCs培养、鉴定结果我们展示了从骨髓中提取EPCs的培养情况。使用Dil-ac LDL及FITC-UEA-1lectin双染阳性的结果显示,培养的是我们实验所需要的细胞。4.通心络对EPCs细胞活性的影响50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的通心络均可促进EPCs细胞增殖、增加细胞活性,然而发现通心络浓度为800μg/mL与1000μg/mL作用的EPCs,细胞活力显著减低,提示我们以下的实验采用400μg/mL以内的刺激浓度。5.通心络作用内皮祖细胞的最佳浓度及作用时间我们的实验发现含通心络浓度为200μg/mL的EGM-2培养液刺激EPCs24小时,CXCR4表达即到达最高值。6. EPCs细胞成管功能检测与空白组相比较,通心络组成管能力显著增高,而加入AMD3100后,这种改善被废除。结论：1.在体实验：通心络可以增强心肌梗死后外周血EPCs的动员；2.在体实验；通心络上调心肌梗死后,心肌组织的SDF-la和CXCR4表达水平；3.200μg/mL通心络刺激EPCs24小时,CXCR4表达量最高,此时EPCs的成管功能明显增强,AMD3100可以废除这种作用。4.通心络通过上调EPCs CXCR4表达,激活SDF-1a/CXCR4增强其细胞功能。