番茄丛枝菌根共生系统中miRNA的组学分析和功能研究

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绝大部分陆地植物都能与特定的真菌共生形成丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)。对多个豆科植物的研究发现植物microRNA(miRNA)参与了AM共生的调节。然而由于对非豆科植物AM共生过程中的miRNA了解甚少,限制了对不同植物类群间保守的调控AM共生的miRNA,以及物种或类群特异性的调控AM共生的miRNA的全面了解。此外,除了植物合成的miRNA,共生真菌是否能够合成milRNA(miRNA-like RNA),并通过合成的milRNA调节宿主共生相关基因的表达目前尚不清楚。本研究通过建立非豆科植物(番茄)与AM真菌(根内球囊菌)的共生体系,利用高通量测序和实验手段对共生系统中的miRNA(和milRNA)展开了研究。我们从宿主植物和AM真菌两个层面出发,分析了宿主植物番茄中保守的以及物种特异性的AM共生响应miRNA;同时探索了AM真菌中是否存在milRNA合成机制,可能存在的milRNA以及其对宿主基因的表达调控。  首先,我们对与根内球囊菌共生的番茄根部组织(实验组)和非共生的番茄根部组织(对照组)进行高通量测序,通过生物信息学方法预测了700个miRNAs。在这些miRNAs中,有187个是已知的植物miRNAs(能够与miRBase数据库中miRNA比对上),剩余513个为番茄中发现的未被miRBase数据库收录的新miRNAs。与拟南芥和水稻等陆地植物中大多数miRNAs的长度为21nt不同,番茄中大多数miRNAs为24nt。进一步分析发现,与番茄演化关系较近的另一茄属植物——土豆中的大多数miRNAs也是24nt;而茄科植物烟草中并未发现大量的24-nt miRNAs,这一结果提示24-nt miRNA可能在茄属植物中发生了特异性的扩张。在所有预测的番茄miRNAs中,有40%的miRNAs的表达量在共生和非共生状态下存在显著性差异。其中5个已知miRNAs和6个番茄特异性的新miRNAs的差异表达进一步得到了RT-qPCR结果的验证。值得注意的是,在验证的5个已知miRNAs中,有3个都属于植物miR171家族。之前曾有研究报道在苜蓿中,miR171能够调节其与AM真菌的共生。因此,miR171很可能是不同植物间保守的调节AM共生的miRNA。此外,通过对差异表达的番茄特异性miRNA进行靶基因预测,获得了超过1000个可能的靶基因,为后续进一步探索番茄特异性的AM共生相关miRNA奠定了基础。  其次,为了探索AM真菌是否具备合成milRNA的能力,我们对真菌milRNA合成的关键蛋白Dicer进行了鉴定和演化分析。通过对真菌子囊菌门、担子菌门和球囊菌门等类群的489个基因组进行了Dicer基因的鉴定,发现该基因在51个基因组中发生了丢失。在具有Dicer基因的物种中,该基因的数目也存在较大差异(1~9个)。其中球囊菌门中的根内球囊菌含有1个Dicer,表明其极有可能具有形成milRNA的能力。进一步对真菌中Dicer的演化特征进行分析发现,在真菌演化早期,Dicer就已经分化为三大支Dicer-A、Dicer-B和Dicer-C。不同真菌类群对Dicer呈现差异性继承,Dicer-A只在担子菌门中被继承,Dicer-B分布相对广泛,在子囊菌门、担子菌门和球囊菌门中都有继承,而Dicer-C在子囊菌门和担子菌门中都有继承。但从Dicer的演化树来看,担子菌门中只有伞菌亚门中存在Dicer-C,并且该类群中的Dicer-C与子囊菌门中盘菌纲的Dicer-C亲缘关系较近,提示担子菌门伞菌亚门中的Dicer-C可能是近期从盘菌纲水平基因转移而来。  最后,我们利用多种分析方法,从与根内球囊菌共生的番茄根部组织的高通量测序数据中对根内球囊菌的milRNA进行了生物信息学预测,获得了27个来源于根内球囊菌的候选milRNAs,并且其中5个得到了探针法RT-qPCR的实验验证。为了了解这些milRNAs对宿主基因可能存在的调控作用,我们对这些milRNAs在番茄中的靶基因进行预测,发现其中的26个milRNAs分别可以在番茄基因组中预测到13-90个数目不等的靶基因。通过RT-qPCR对部分靶基因的表达量进行验证,发现番茄中两个基因的表达量在与AM共生后存在显著性变化。其中基因(ERF119-like)在烟草叶片中的瞬时表达实验表明,番茄基因ERF119-like与根内球囊菌milR-12在体外存在相互作用,暗示根内球囊菌的这个milRNA有可能通过对宿主植物基因发挥了调控作用。这为进一步探索根内球囊菌milRNAs在共生中的生物学作用提供了参考。
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