构建自催化复制体系用于超灵敏检测DNA糖基化酶

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基因组DNA的准确性和完整性对所有生命体至关重要,但是其经常遭受到持久性的氧化损伤,导致突变、衰老和疾病等发生,8-羟基鸟嘌呤(8-oxoGuanine,8-oxoG)是其中重要的一种。为了维持基因组的稳定性,细胞进化出碱基切除修复(base excision repair,BER)系统来应对以上损伤以完成修复。人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶(human 8-oxoGuanine DNA glycosylase,hOGG1)通过特异性识别和修复8-oxoG来启动BER路径的第一步,其活性的异常表达与肺癌、膀胱癌和自身免疫炎症等多种疾病密切相关。因此,准确检测hOGG1的活性对于评估基因组DNA的氧化损伤水平至关重要。分子自我复制是生物体的基本功能,能够模板化和催化自身的合成,在化学进化和合成机制中发挥着重要作用。然而,体外自我复制系统的构建目前仍然是一个挑战,且在生物传感构建中的应用也比较少。因此,我们构建了一个酶促核酸自我复制系统,用于hOGG1活性的检测。在本方案中,hOGG1切除8-oxoG并展开发夹底物,激活分子信标(molecular beacons,MBs)的自催化过程,使之产生核酸模板和信号输出,从而导致生物DNA模板的连续自我复制和分子信标(即MB1和MB2)的重复切割,产生增强荧光信号。该方法可以灵敏地检测hOGG1活性,检测限低至4.3×10-7 U/μL,动态范围为1.0×10-60.05 U/μL(达5个数量级)。此外,该方法可用于酶动力学参数的测定、hOGG1抑制剂的筛选、甚至单个肺癌细胞hOGG1活性的定量,为DNA修复相关的生物医学研究和临床诊断提供了一种新的方法。
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