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萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)又称莱菔子素,是一种含硫有机化合物,是目前防癌抗癌效果最好的植物天然产物之一,它能诱导机体产生II型解毒酶,使癌细胞程序性凋亡并起到防癌功能。十字花科芸薹属植物西兰花是生产SFN的重要材料,但目前普通西兰花中SFN产量仍无法满足巨大的市场需求,使用成苗作为生产材料会大幅增加生产成本,通过西兰花无菌细胞系生产SFN可缩短生产周期,是一种新型生产方式。之前单一基因改造提高植物SFN含量的策略效果并不理想。本研究从西兰花中克隆了 SFN合成相关的支链氨基酸转移酶4编码基因BCAT4、细胞色素P450氧化酶编码基因CYP79F1和环硫修饰酶编码基因ESM1。分别以单基因导入和三基因串联导入的方式,通过农杆菌法转化西兰花愈伤组织,对所获得的转化细胞系中SFN的含量进行比较,以期获得SFN含量更高的细胞系,为通过细胞系大量培养获取SFN奠定基础。本文主要研究结果如下:1、目的基因克隆:提取西兰花总RNA,并反转录出cDNA;利用ESM1(GenBank No.XM013728577.1)、CYP79F1(GenBank No.MG012890.1)、BC4 T4(GenB ank No.XM013728260.1)的CDS序列设计扩增引物并进行PCR反应,将PCR扩增得到的目的基因纯化回收。2、单基因过表达载体的构建:通过重组反应,将单个目的基因连接到载体XF-350 上,获得单基因重组载体:XF350-ESM1,XF350-BC4T4,XF350-CYP79F1,双酶切鉴定及测序结果表明载体构建成功。3、多基因串联过表达质粒的构建:将单基因重组载体XF350-ESM1、XF350-CYP79F1、XF350-BC4T4 作为 PCR 模板,扩增表达框:SESM1(35S 启动子编码序列+HA标签蛋白编码序列+ESM1蛋白编码序列)、SCYP79F1N(35S启动子编码序列+HA标签蛋白编码序列+CYP79F1蛋白编码序列+His标签蛋白编码序列+Nos 3’ UTR)、BCAT4N(BCAT4蛋白编码序列+His标签蛋白编码序列+Nos 3’UTR),通过同源重组的方式将三个基因表达框串联在载体上,获得三基因串联过表达载体:XF350-BCAT4N-SCYP79F1N-SESM1(XF350-B-C-E),双酶切鉴定及测序结果表明载体构建成功。4、农杆菌转化及转基因细胞的分子生物学检测:通过农杆菌转化以及抗生素筛选得到抗性西兰花细胞;抗性细胞的DNA分子水平检测初步证明目的基因与宿主细胞的基因组DNA成功整合;RT-PCR检测结果表明,目的基因BCAT4、CYP79F1、ESM1和BCAT4N-SCYP79F1N-SESM1(B-C-E)都可以在宿主细胞内过量表达。5、转基因细胞SFN含量检测:通过高效液相色谱法检测各细胞系SFN含量,BCAT4和B-C-E基因过表达细胞系中SFN含量为139.7 μg/g和171.4 μg/g,分别是野生型细胞系SFN含量的1.79倍和2.19倍,差异极显著;B-C-E基因过表达细胞系SFN含量是BCAT4基因过表达细胞系的1.23倍,差异显著。CYP79F1和ESM1过表达细胞系未检测到高于对照的SFN含量。综上所述,通过对西兰花细胞进行基因改造,单基因BC4T4的过表达对SFN含量的影响大于CYP79F1与ESM1,多基因串联共表达对SFN含量的影响效果好于单个基因的过表达。