自噬相关基因LC3B在白藜芦醇诱导白血病HL-60细胞自噬中的作用

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目的:  通过研究白藜芦醇(Resveratrol,Res)作用于白血病HL-60细胞后检测细胞自噬的发生,同时探讨其引起自噬的可能机制,试图为白血病治疗提供新的思路。  方法:  1.体外培养HL-60细胞株,取对数生长期的细胞进行实验研究。  2.不同浓度Res(0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)作用HL-60细胞12h后通过单丹酰戊二胺(Dansylcadaverine,MDC)荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察自噬现象的发生。  3.100μmol/L Res作用HL-60细胞不同时间(0h,6h,12h,24h,36h,48h)后MDC荧光染色后用流式细胞仪检测自噬比率。  4.不同浓度Res(0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)作用于HL-60细胞不同时间(0h,6h,12h,24h)后用Real-Time PCR检测自噬相关基因LC3BmRNA的表达水平。  5.100μmol/L Res作用于HL-60细胞不同时间(0h,6h,12h,24h)后用Western Blot检测自噬相关基因LC3B蛋白的表达水平。  6.100μmol/L浓度的Res分别加入5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L PI3K的抑制剂Wortmannin12h后用Real-Time PCR和Western Blot检测自噬相关基因LC3BmRNA与蛋白的表达水平。  结果:  1.实验结果显示激光共聚焦显微镜下观察发现50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L Res的的实验组可见到许多明显的深蓝色点状MDC募集的颗粒散布于HL-60细胞的胞浆内,表示有自噬囊泡的出现,而对照组HL-60细胞只发出少量淡蓝色荧光,结果表明Res可能具有诱导HL-60细胞发生自噬的作用。  2.100μmol/L Res作用HL-60细胞0h,6h,12h,24h,36h,48h后流式细胞仪检测其自噬率,实验组自噬率较对照组的高,差异具有统计学意义(P<0.01),其中自噬率并没有随着时间的延长而增加,Res作用细胞6小时后自噬率即有明显升高,12小时达高峰。  3.不同浓度Res(0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)作用于HL-60细胞不同时间(0h,6h,12h,24h)后,通过Real-Time PCR检测发现自噬相关基因LC3BmRNA在100μmol/L Res作用于HL-60细胞时表达量较高,而且随着作用时间延长而升高。  4.不同浓度(0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/LRes)作用于HL-60细胞,实验组自噬相关基因LC3B蛋白表达水平和对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。  5.100μmol/L浓度的Res联合5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/LPI3K的抑制剂Wortmannin12h后自噬相关基因LC3BmRNA与蛋白的表达水平均有下降,和空白对照组相比,差异具有统计学意义;Res联合不同浓度的Wortmannin组的LC3BmRNA与蛋白的表达水平和单独加入Res组的相比,差异具有统计学意义。  结论:  1.Res可诱导HL-60细胞发生自噬。  2.PI3K抑制剂Wortmannin能下调自噬相关基因LC3BmRNA与蛋白的表达水平,说明在Res诱导HL-60细胞发生自噬的机制可能与PI3K通路有关。
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