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叶色突变是自然中较容易发现的突变性状之一，而在众多的叶色突变体中，黄色叶片是自然界中最醒目、明度最高的色彩。黄叶突变体是研究叶绿素合成，叶绿体发育及质体-核反向信号传递的理想材料。先前，研究团队在开展白桦转BpCCR1基因过表达研究中，获得了一株T-DNA插入黄叶突变株(yl株系)。本研究以yl株系为试材，分离插入位点的侧翼序列，开展突变基因的定位与克隆，阐明突变基因的功能。研究结果不仅为提高白桦光合性能创造生产上有价值的林木新品种提供指导，也为园林绿化彩叶树基因工程育种提供基因资源。具体研究结果如下:
选取BpCCR1过表达株系C11和野生型白桦WT作为对照株系，对yl株系的色素含量、叶片解剖结构、叶绿体发育、光合特性、生长性状及基因表达特性等方面进行分析。结果表明，yl株系的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均显著低于2个对照株系，而叶绿素a/b的比值却显著高于对照株系。叶片组织的显微解剖观察显示，yl株系的叶片、上表皮、下表皮、栅栏组织和海绵组织的厚度均显著低于2个对照株系。超微结构观察发现，yl株系叶绿体中的基粒片层和基质片层的厚度与对照株系相比显著变薄，并且淀粉粒变少变小。对yl的光合性能及苗高的测定发现，yl株系的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及苗高显著低于2个对照，而实际和最大光化学效率却没有受到影响。转录组测序结果表明，yl株系叶片中基因的表达发生了明显变化。与WT相比，在yl中共检测到930个差异表达基因，包括175个基因上调表达和755个基因下调表达。与C11相比，在yl中共检测到1163个差异表达基因，包括289个基因上调表达和874个基因下调表达。对这些差异基因进行KEGG富集分析发现，yl与C11和yl与WT的差异表达基因均是在光合作用-天线蛋白这一途径中显著富集。
采用TAIL-PCR、NGS和PacBio基因组重测序的方法对yl基因组T-DNA整合位点进行分析。结果表明，yl株系基因组共有6个T-DNA插入位点，即IS1(Chr223466399),IS2(Chr226269259),IS3(Chr85168622),IS4(Chr817725909),IS5(Chr91671992)，IS6(Chr119184715)，其中IS1，IS2，IS4和IS6位点上下游5kb范围内没有检测到基因，IS3位于BpPAL2（Bpev01.c0990.g0002.m0001）基因上游885bp处，IS5位于BpSMT2(Bpev01.c0577.g0001.m0001)基因下游2386bp处和BpCDSP32(Bpev01.c0577.g0002.m0001)基因上游1674bp处。实时荧光定量PCR结果显示，yl中BpPAL2，BpSMT2和BpCDSP32基因的表达量与C11和WT对照株系没有明显差异。进一步对yl中T-DNA的整合进行分析发现，T-DNA的整合引起yl的3条染色体片段Chr2-3、Chr8-1和Chr8-3发生易位，3条染色体片段Chr2-2，Chr2-5和Chr9-1丢失。这些结果使得Chr2上的40kb序列是纯合缺失，而纯合缺失区域包含一个BpGLK1(Bpev01.c0167.g0013.m0001)基因。初步确定yl株系黄叶性状是由于BpGLK1的缺失所致。
PCR和RT-PCR结果显示，yl株系在DNA水平和mRNA转录水平均不能检测到BpGLK1基因。BpGLK1的功能互补实验结果显示，将BpGLK1基因通过农杆菌介导法转入yl株系，以及采用yl株系为母本、野生型白桦为父本的杂交育种手段，得到的转基因株系（C-yl株系）及杂交子代其叶色均得到恢复，C-yl株系的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量及叶绿素a/b值均恢复到野生型水平。
采用农杆菌介导法进行白桦BpGLK1的遗传转化，共获得6个过表达株系和8个抑制表达株系。BpGLK1过表达株系表现为叶片绿色加深，叶绿素含量略高于野生型。叶绿体中淀粉粒与野生型相比较大、较多;BpGLK1抑制表达株系与yl表型相似，叶色黄化，叶绿素含量减少，叶绿体的基粒片层和基质片层变薄，并且淀粉粒变少、变小。
对BpGLK1过表达株系和抑制表达株系的功能叶片进行转录组测序，结果显示，过表达转基因株系共筛选到883个差异基因，其中546个基因表达量上调，337个基因表达量下调。在BpGLK1抑制表达株系中，共筛选到1553个差异表达基因，包括638个上调表达的基因和915个下调表达的基因，对差异表达基因进行GO功能富集结果显示，与光合作用相关的生物进程光系统I捕光天线，捕光天线以及光反应相关基因在BpGLK1抑制表达株系中被显著富集。BpGLK1抑制表达株系的蛋白质组测序结果显示，差异表达蛋白主要富集在碳水化合物代谢生物进程中，这与BpGLK1抑制表达株系叶绿体中淀粉粒变小是相关的。ChIP-PCR实验显示，BpGLK1蛋白可能调控的靶基因是:8个天线蛋白相关基因、5个光系统亚基相关基因和4个叶绿素合成相关基因。
综上所述，本研究对T-DNA插入突变体yl株系表型及突变基因进行了鉴定，总结了T-DNA的整合模式，并对突变基因BpGLK1的功能进行了探究，揭示了BpGLK1基因参与调控白桦叶片的叶绿体发育和叶色形成机制。研究结果可为GLK1基因在木本植物中的应用提供依据参考，使得人们按照园林绿化的目标需求通过分子设计育种技术创制黄叶性状树木成为可能。同时获得的白桦BpGLK1抑制表达株系可为园林绿化提供黄色彩叶树木资源。
选取BpCCR1过表达株系C11和野生型白桦WT作为对照株系，对yl株系的色素含量、叶片解剖结构、叶绿体发育、光合特性、生长性状及基因表达特性等方面进行分析。结果表明，yl株系的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均显著低于2个对照株系，而叶绿素a/b的比值却显著高于对照株系。叶片组织的显微解剖观察显示，yl株系的叶片、上表皮、下表皮、栅栏组织和海绵组织的厚度均显著低于2个对照株系。超微结构观察发现，yl株系叶绿体中的基粒片层和基质片层的厚度与对照株系相比显著变薄，并且淀粉粒变少变小。对yl的光合性能及苗高的测定发现，yl株系的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及苗高显著低于2个对照，而实际和最大光化学效率却没有受到影响。转录组测序结果表明，yl株系叶片中基因的表达发生了明显变化。与WT相比，在yl中共检测到930个差异表达基因，包括175个基因上调表达和755个基因下调表达。与C11相比，在yl中共检测到1163个差异表达基因，包括289个基因上调表达和874个基因下调表达。对这些差异基因进行KEGG富集分析发现，yl与C11和yl与WT的差异表达基因均是在光合作用-天线蛋白这一途径中显著富集。
采用TAIL-PCR、NGS和PacBio基因组重测序的方法对yl基因组T-DNA整合位点进行分析。结果表明，yl株系基因组共有6个T-DNA插入位点，即IS1(Chr223466399),IS2(Chr226269259),IS3(Chr85168622),IS4(Chr817725909),IS5(Chr91671992)，IS6(Chr119184715)，其中IS1，IS2，IS4和IS6位点上下游5kb范围内没有检测到基因，IS3位于BpPAL2（Bpev01.c0990.g0002.m0001）基因上游885bp处，IS5位于BpSMT2(Bpev01.c0577.g0001.m0001)基因下游2386bp处和BpCDSP32(Bpev01.c0577.g0002.m0001)基因上游1674bp处。实时荧光定量PCR结果显示，yl中BpPAL2，BpSMT2和BpCDSP32基因的表达量与C11和WT对照株系没有明显差异。进一步对yl中T-DNA的整合进行分析发现，T-DNA的整合引起yl的3条染色体片段Chr2-3、Chr8-1和Chr8-3发生易位，3条染色体片段Chr2-2，Chr2-5和Chr9-1丢失。这些结果使得Chr2上的40kb序列是纯合缺失，而纯合缺失区域包含一个BpGLK1(Bpev01.c0167.g0013.m0001)基因。初步确定yl株系黄叶性状是由于BpGLK1的缺失所致。
PCR和RT-PCR结果显示，yl株系在DNA水平和mRNA转录水平均不能检测到BpGLK1基因。BpGLK1的功能互补实验结果显示，将BpGLK1基因通过农杆菌介导法转入yl株系，以及采用yl株系为母本、野生型白桦为父本的杂交育种手段，得到的转基因株系（C-yl株系）及杂交子代其叶色均得到恢复，C-yl株系的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量及叶绿素a/b值均恢复到野生型水平。
采用农杆菌介导法进行白桦BpGLK1的遗传转化，共获得6个过表达株系和8个抑制表达株系。BpGLK1过表达株系表现为叶片绿色加深，叶绿素含量略高于野生型。叶绿体中淀粉粒与野生型相比较大、较多;BpGLK1抑制表达株系与yl表型相似，叶色黄化，叶绿素含量减少，叶绿体的基粒片层和基质片层变薄，并且淀粉粒变少、变小。
对BpGLK1过表达株系和抑制表达株系的功能叶片进行转录组测序，结果显示，过表达转基因株系共筛选到883个差异基因，其中546个基因表达量上调，337个基因表达量下调。在BpGLK1抑制表达株系中，共筛选到1553个差异表达基因，包括638个上调表达的基因和915个下调表达的基因，对差异表达基因进行GO功能富集结果显示，与光合作用相关的生物进程光系统I捕光天线，捕光天线以及光反应相关基因在BpGLK1抑制表达株系中被显著富集。BpGLK1抑制表达株系的蛋白质组测序结果显示，差异表达蛋白主要富集在碳水化合物代谢生物进程中，这与BpGLK1抑制表达株系叶绿体中淀粉粒变小是相关的。ChIP-PCR实验显示，BpGLK1蛋白可能调控的靶基因是:8个天线蛋白相关基因、5个光系统亚基相关基因和4个叶绿素合成相关基因。
综上所述，本研究对T-DNA插入突变体yl株系表型及突变基因进行了鉴定，总结了T-DNA的整合模式，并对突变基因BpGLK1的功能进行了探究，揭示了BpGLK1基因参与调控白桦叶片的叶绿体发育和叶色形成机制。研究结果可为GLK1基因在木本植物中的应用提供依据参考，使得人们按照园林绿化的目标需求通过分子设计育种技术创制黄叶性状树木成为可能。同时获得的白桦BpGLK1抑制表达株系可为园林绿化提供黄色彩叶树木资源。