研究背景与目的急性肝衰竭是由多种原因引起的肝细胞亚大片或大片坏死,致使肝脏功能严重受损一种临床症候群。该病病情凶险,进展迅速,病死率高,是严重威胁人类健康的疾病之一。目前,肝移植是该病最有效的治疗方法,但因肝脏供者的缺乏和手术价格昂贵而受到限制。近些年来,许多研究发现通过移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)来治疗急性肝衰竭已成为一种很有前途的治疗方式。但其疗效有限。主要原因是移植细胞后归巢于损伤肝脏的细胞数目过少,以及归巢的细胞分化再生能力差。因此,目前迫切需要提高骨髓间充质干细胞移植后的归巢能力,从而改善其治疗急性肝衰竭的疗效。目前,已有研究指出急性肝衰竭患者的肝脏内肝细胞生长因子(HGF)的浓度较正常肝脏明显升高。且研究发现HGF/c-met信号通路在诱导骨髓间充质干细胞向损伤肝脏的归巢过程中发挥着重要的作用。在本研究中,我们通过构建稳定表达c-met基因的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株(c-met-BMSCs),旨在证明损伤肝脏内高浓度的HGF可诱导c-met-BMSCs向急性肝衰竭大鼠损伤肝脏定向归巢,以提高骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的疗效。方法1.构建c-met慢病毒表达载体,并将此慢病毒稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞,从而建立稳定表达c-met基因的骨髓间充质干细胞细胞株(c-met-BMSCs)。接着采用transwell系统体外观察不同浓度的肝细胞生长因子(HGF)诱导c-met-BMSCs迁移的能力。2.取36只SD大鼠随机分为3组(移植c-met-BMSCs治疗组、移植BMSCs治疗组和对照组),每组12只。采用D-氨基半乳糖(D-Gal N)和脂多糖(LPS)联合腹腔注射的方式制造大鼠急性肝衰竭模型,造模完成24h后,c-met-BMSCs组和BMSCs组急性肝衰竭大鼠分别经尾静脉注射c-met-BMSCs和BMSCs(注射细胞数为1.0×107/kg溶于1ml生理盐水中),对照组急性肝衰竭大鼠尾静脉注射1ml生理盐水。然后每天观察并记录三组大鼠的生存情况,并收集三组大鼠造模后不同时间点(0,24,48,72h)静脉血行肝功能检测及造模后24、48和72h的肝组织标本,采用HE染色后观察肝组织病理变化并进行HAI评分。3.采用染料DIR分别染色标记c-met-BMSCs和BMSCs,将标记的细胞以相同的细胞数(1×106)通过尾静脉分别输入到急性肝衰竭大鼠体内。24h后采用活体成像系统观察两组细胞向大鼠损伤肝脏的迁移情况及记录肝脏处的辐射效率。结果1.经PCR鉴定及测序结果显示c-met慢病毒表达载体构建成功,慢病毒滴度为2×108TU/ml。将此慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率高于99%,且Western blot证实该细胞株过表达c-met蛋白,即成功构建了稳定表达c-met基因的骨髓间充质干细胞细胞株(c-met-BMSCs)。此外,体外transwell迁移实验表明肝细胞生长因子(HGF)具有诱导c-met-BMSCs定向迁移的能力。2.制造大鼠急性肝衰竭模型,在造模24、48小时后其肝脏内HGF浓度明显升高。治疗急性肝衰竭大鼠,移植c-met-BMSCs治疗组、移植BMSCs治疗组和对照组三组急性肝衰竭大鼠的生存率分别为83.3%、50%和0%。与移植BMSCs治疗组和对照组相比,移植c-met-BMSCs治疗组可显著改善大鼠肝功能及降低损伤肝组织HAI评分。3.活体成像系统显示移植c-met-BMSCs治疗组的大鼠肝脏处的辐射效率是移植BMSCs治疗组的20倍,表明移植c-met-BMSCs可明显提高归巢于损伤肝脏的细胞数。结论成功构建了c-met慢病毒表达载体,并建立了稳定表达c-met基因的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株(c-met-BMSCs)。且该细胞株治疗急性肝衰竭大鼠时可靶向归巢于损伤肝脏,从而加快了急性肝衰竭的修复过程。