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卵巢癌为妇科生殖器官常见恶性肿瘤之一,死亡率居妇科肿瘤首位。目前,对于卵巢癌的标准治疗是最佳减瘤手术配合铂类化疗药物的组合治疗。但由于缺乏有效的早期诊断手段和肿瘤对常规化疗药物的耐药性,卵巢癌治疗效果并不显著,如何提高化疗药物对卵巢癌的治疗效果,是医学上亟待解决的问题。青蒿琥酯是从中药青蒿中提取的一种倍半萜内酯类化合物,是目前治疗重症疟疾的首选药物。近年来的研究表明,青蒿琥酯可以通过升高肿瘤细胞活性氧(ROS)和DNA损伤水平,诱导细胞走向凋亡和细胞周期阻滞等多种途径,达到抑制肿瘤生长的效果。且相比于野生型的细胞,碱基切除修复(Base excision repair, BER)和同源重组修复(Homologous recombination, HR)缺陷的细胞对青蒿琥酯更为敏感,说明青蒿琥酯诱导的DNA损伤主要由BER和HR途径完成修复。同源重组修复可以修复多种DNA损伤,包括双链DNA断裂和链间交联。RAD51蛋白是HR修复过程中的关键蛋白,负责催化同源DNA链间的交换。RAD51在多种肿瘤中高表达,由此所导致的DNA修复能力的增强导致肿瘤细胞对放疗、化疗和靶向治疗等多种治疗产生耐受。因而下调RAD51蛋白表达水平有望会克服肿瘤的化疗和放疗耐受。本课题研究了青蒿琥酯对卵巢癌细胞的杀伤作用以及青蒿琥酯对RAD51的负调控作用。结果显示,青蒿琥酯既能诱导卵巢癌细胞的DNA双链断裂,又能下调同源重组蛋白RAD51的表达,后一功能显著增加了卵巢癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性。[研究目的]本课题以卵巢癌细胞和小鼠体内移植瘤为模型,研究联合青蒿琥酯和顺铂的抗肿瘤作用及其机制。[研究方法]一、利用CCK-8方法检测青蒿琥酯对人卵巢癌细胞的增殖抑制作用。二、利用Annexin V和PI双染法检测青蒿琥酯处理卵巢癌细胞的凋亡情况。三、利用流式细胞术检测青蒿琥酯处理卵巢癌细胞后ROS水平变化情况。四、利用平板克隆形成法检测联合青蒿琥酯和顺铂对卵巢癌细胞生长的抑制作用。五、利用Western blot和Real-time PCR技术检测青蒿琥酯处理肿瘤细胞和正常细胞RAD51, Parp-1,Ku80, XRCC1等相关损伤修复蛋白表达水平。六、利用免疫荧光,Western blot方法检测青蒿琥酯处理后,卵巢癌细胞γ-H2AX的焦点形成及蛋白表达。七、利用免疫荧光检测青蒿琥酯预处理卵巢癌细胞对RAD51焦点形成的影响。八、利用裸鼠的体内卵巢癌移植瘤模型,评估联合青蒿琥酯和顺铂治疗卵巢癌的效果。九、利用RAD51高表达的卵巢癌细胞系,进一步确定青蒿琥酯的化疗增敏作用由RAD51下调介导。十、利用荧光素酶报告基因实验检测青蒿琥酯对RAD51启动子活性的影响。[实验结果]一、青蒿琥酯通过诱导卵巢癌细胞的凋亡抑制细胞增殖,且具有剂量依赖性。二、青蒿琥酯诱导卵巢癌ROS水平的上升和DNA双链断裂的产生。三、青蒿琥酯下调肿瘤细胞内同源重组蛋白RAD51的表达,对正常细胞RAD51蛋白表达没有影响。四、青蒿琥酯处理下肿瘤细胞RAD51焦点形成受阻。五、青蒿琥酯能增加顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用,联合青蒿琥酯和顺铂对卵巢癌抑制作用具有明显的协同效应。六、异位高表达RAD51可降低联合青蒿琥酯和顺铂对卵巢癌的杀伤作用。七、青蒿琥酯增加体内顺铂治疗卵巢癌效果,联合用药明显抑制了卵巢癌移植瘤的生长。[结论]青蒿琥酯既可诱导卵巢癌细胞ROS水平上升,DNA双链断裂的产生,也可下调RAD51蛋白的表达。青蒿琥酯可增加顺铂治疗卵巢癌的效果。