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褪黑素对糖尿病肾病的保护作用及其机制的研究 随着经济发展和生活方式改变,糖尿病患病率逐渐上升,糖尿病及其并发症已成为严重威胁人民健康的世界性公共卫生问题。糖尿病肾病已成为终末期肾功能衰竭的主要原因之一,严重影响了患者的生活质量。目前对糖尿病慢性并发症发病机理进行的研究日益增多,但其发病机制尚未完全阐明。氧化应激作为其发病机制之一,受到广泛关注,对其进行的基础和临床研究也逐渐增多。人们认为糖尿病病人和糖尿病实验模型中均存在氧化应激。活性氧除可直接损伤肾脏组织,还是许多细胞因子损伤肾组织的最终介质,活性氧甚至可作为信号分子,激化细胞内信号转导通路。故而,在临床工作中选用合适的抗氧化剂以延缓糖尿病肾病的发生、发展具有重要的临床意义。 褪黑素(Melatonin,Mel)是由松果体分泌的一种神经内分泌激素,过去人们认为它的作用主要是调节生物体的生理周期性节律。近年来,随着人们对Mel研究的不断深入,逐渐发现它还具有调节生殖系统功能、镇静催眠、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等重要的生理、药理作用。近年来的研究集中于其抗氧化特性,认为可能与其抗肿瘤、抗衰老特性有关。目前认为其抗氧化机制主要包括两方面:一方面,以电子供体的形式直接中和羟自由基和过氧化自由基;另一方面,通过激活谷胱甘肽过氧化酶、抑制一氧化氮合酶活性起间接抗氧化作用。是目前已知的抗氧化作用最强的自由基清除剂。 本研究运用多种实验技术和方法,旨在阐明以下几个问题:1.Mel对糖尿病大鼠肾脏的保护作用;2.研究高糖环境对大鼠系膜细胞株增殖的影响以及Mel的干预作用;3.进行体内、体外试验探讨糖尿病状态下抗氧化酶活性和脂质过氧化物含量的变化及Mel干预的效果;4.进行体内、体外试验探讨糖尿病状态下肾脏细胞因子TGF-β1表达量的改变及Mel的作用;。 本研究的主要方法和结果: 第一部分:方法:3月龄SD大鼠予链脲佐菌素(STZ)腹腔注射,诱导糖尿病模型。将大鼠随机分为4组:(1)正常对照组(CN);(2)糖尿病对照组(DM);(3)小剂量Mel治疗组(DM+Mel1,0.2 mg/kg.d);(4)大剂量Mel第二军医大学博士论文中文摘要治疗组(DM+MelZ,smg瓜g.d)。检测Mel治疗。、4、s周时的体重、血糖、血甘油三醋、总胆固醇水平作为一般情况及血生化指标;检测血肌醉、尿肌醉、尿蛋白排泄量,计算肌配清除率作为肾功能指标;计算肾重/体重比值、电镜检查、队S染色、HE染色光镜下运用半自动影像分析系统测量PAS染色阳性面积、’肾小球面积和小球内细胞数作为形态学指标。结果:Mel治疗对糖尿病大鼠体重、血糖、胆固醇水平无显著影响,但可使血甘油三醋水平减低。Mel干预还可使糖尿病大鼠尿蛋白排泄量减少、肾重/体重比值降低,电镜显示基底膜增厚减轻、足突融合现象减少,系膜区PAS阳性物质沉积增多减轻,肾小球面积减少,小球内细胞数减少。其作用效果与药物剂量呈正相关。 第二部分:方法:选用大鼠系膜细胞株,依据培养基中葡萄糖浓度的不同,将其分为低糖组(5ol/L)、高糖组(20mmol/L),在高糖组中加入不同浓度Mel(10一,3、10一”、10一9、10一7、10一,mmol/L),培养72小时,应用3一(4,5)一双甲基一2一唆哇一(2,5)一二苯基漠化四氮哇蓝(MTT)法观察高糖环境对大鼠系膜细胞株增殖的影响以及Mel干预对系膜细胞增殖影响的情况。分别在Mel的生理浓度(10一”mmol几)及药理浓度(10一’mmol/L)组加用Mel的受体阻断剂Luzindole,观察其对Mel作用的影响。结果:高糖环境对系膜细胞的增殖有明显促进作用;Mel可抑制高糖状态下的系膜细胞增殖,其作用在生理浓度(10一,,mmol/L)时即有显著意义(P<0.05),Mel各浓度组间差异比较无显著性意义;Mel的抑制增殖作用可被Mel的受体阻断剂Luzindole部分逆转。 第三部分:方法:1.体内试验部分:各组大鼠予Mel治疗4周、8周时眶后静脉取血,比色法测定糖尿病大鼠红细胞SOD活性、全血GSH一Px活性、血浆MDA含量作为系统氧化应激状态的监测指标;予Mel治疗8周后处死,取肾脏组织,制备匀浆,测定大鼠肾脏SOD活性、GSH一Px活性、MDA含量作为肾脏局部氧化应激状态的监钡g指标。2.体外试验部分:选用大鼠系膜细胞株,将其分为低糖对照组(smmol/L)、高糖对照组(20mmol/L)、高糖(20mmol/L)+生理浓度Mel(10一”mmol/L)组、高糖(20mmol/L)+药理浓度Mel(10一’mmol几)组四组。培养72小时后,观测培养液中抗氧化酶活性和脂质过氧化物水平的改变及Mel对其影响,作为体内试验的氧化应激状态的监测指标。结果:1.体内试验结果:与CN组大鼠比较,DM组大鼠肾皮质MDA含量明显第二军医大学博士论文中文摘要增加,而肾组织内在抗氧化酶(AOES)包括SOD、GSH一Px活性显著降低。Mel治疗可使糖尿病大鼠肾脏SOD和GSH一Px活性明显增加、并使肾皮质MDA含量降低。其作用效应与药物剂量呈正相关。同时,DM组大鼠的血浆MDA水平明显升高,并伴有红细胞SOD活性下降,此现象随病程延长有逐渐加重的趋势,接受大剂量Mel治疗的糖尿病大鼠上述改变有所?