微小RNA(MicroRNA，miRNA)是类非编码小RNA，成熟形式的miRNA长度约为18-22个核苷酸(nt)。它由DNA转录产生，但并不翻译成蛋白质，而是在蛋白质合成中发挥调节功能。miRNA能与其他蛋白质编码基因的mRNA转录本反向互补，调控其他蛋白质的翻译。最先发现的microRNA是在线虫中观察到的lin-4和let-7，线虫的发育受这些小RNA的控制。随后miRNA被发现存在于包括从线虫到果蝇以及人的多种组织中，提示这些分子可能代表个从古老的小RNA祖先进化而来的基因家族，在各个物种间保有高度的进化保守性。MicroRNA是调节其它功能基因表达的重要的调节分子，它参与生命过程的系列的重要进程，包括胚胎发育、免疫细胞分化、肿瘤的发生发展及组织代谢等许多重要生物学过程。人体的免疫系统至关重要，哺乳动物的免疫系统在抵抗感染、自身稳定和免疫监视方面发挥重要作用。为达到免疫应答和免疫耐受的恰当平衡,免疫反应的起始、终止和反应强度必须被严格调节。miRNAs更适合对免疫系统进行精细调节和定量调节，因为，miRNA长度为18-22个碱基，通过部分互补配对就可以对靶mRNA起到抑制作用，并且，可以根据病原体的进化而针对其发生突变，发挥了重要的基因调节子储存库的作用。许多研究小组证明microRNA在适应性免疫应答方面发挥至关重要的作用：包括调控不同种类细胞亚群的分化及功能。深入理解miRNA与免疫体统调节的关系，有利于我们深入理解人体发挥免疫作用的新机制，更有利于我们对自身免疫性疾病的治疗找到新的突破口，保持内环境稳态。越来越多的实验小组致力研究miRNA与T细胞的关系，越来越多的免疫相关miRNA被报道，但是，miRNA在T细胞特别是CD4~+T细胞活化中的作用，仍然很不明确，为了更好的解答这个问题，我们课题组进步深入研究了miRNA在T细胞活化和分化过程中的生物学功能，这更有助于我们更好的理解调节适应性免疫应答的机制。为了研究在CD4~+T淋巴细胞活化过程中发挥作用的miRNA，我们进行基因芯片来筛选与CD4~+T淋巴细胞活化相关的microRNAs，发现在活化的T细胞中，miR-202*、miR-33b、miR-568和miR-576的表达明显下调。靶基因鉴定实验，发现了miR-568的直接靶基因，所以我们把miR-568做为我们实验的研究对象，进行下步研究。截止目前，尚未有实验室具体研究miR-568的功能。那么，microRNA基因表达谱芯片结果显示的Jurkat细胞活化后表达明显下降的miR-568是否参与了CD4~+T淋巴细胞活化信号的调控？CD4~+T淋巴细胞活化过程中，miR-568的靶基因是什么？本课题将对此进行探讨。目的：1)筛选与T细胞活化相关的microRNA；2)研究miR-568在CD4~+T淋巴细胞活化的作用；3)探讨CD4~+T淋巴细胞活化过程中miR-568的下游靶基因及其通路；4)初步研究miR-568对调节性CD4~+T (Treg)细胞亚群功能的影响。方法：1)利用Exiqon miRNA基因表达谱芯片筛选与T细胞活化相关的microRNA；2)利用实时定量PCR检测Jurkat和人CD4~+T淋巴细胞活化前后miR-202*、miR-33b、miR-568和miR-576的表达变化；3)构建miR-568的真核表达载体，合成其mimics；4)用流式细胞术检测转染miR-568的Jurkat及人CD4~+T淋巴细胞活化前后表面活化标志CD25、CD69和CD154的表达情况；5)通过生物信息学方法预测miR-568的靶基因；6)构建双荧光素酶报告基因载体，用双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR和Western Blot等方法验证miR-568的靶基因。7)用实时定量PCR、ELISA检测转染了miR-568的Jurkat及人CD4~+T淋巴细胞活化前后IL-2的表达变化，用MTT检测miR-568对人CD4~+T淋巴细胞增殖的影响；8)用免疫磁珠的方法分离人CD4~+CD25~+Treg淋巴细胞；9)实时定量PCR和western blot分别检测活化前后人CD4~+CD25~+Treg淋巴细胞中miR-568和NFAT5表达的变化；10) ELISA检测转染miR-568对Treg活化后分泌效应细胞因子IL-10、TGF-β的影响；11) MTT检测miR-568对Treg细胞增殖能力的影响；12) CCK-8检测miR-568对Treg细胞抑制效应T细胞增殖能力的影响。13)利用NFAT5siRNA下调CD4~+CD25~+Treg细胞中NFAT5的表达，刺激CD4~+CD25~+Treg细胞活化后，通过ELISA检测效应细胞因子IL-10、TGF-β的分泌水平；14)利用NFAT5siRNA下调CD4~+T细胞中NFAT5的表达，通过流式检测NFAT5对CD4~+T细胞向CD4~+CD25~+Treg细胞转化的效率。结果：1) miR-568可明显抑制Jurkat及人CD4~+T淋巴细胞的活化。我们利用Exiqon miRNA基因表达谱芯片，筛选到Jurkat细胞活化后有4个microRNA的表达明显下调：miR-202*、miR-33b、miR-568和miR-576。实时定量PCR结果表明，这4个microRNA在活化的Jurkat细胞和人CD4~+T细胞中的表达水平明显下降。这里，我们着重研究了miR-568这个分子，我们检测了不同时间点miR-568的表达情况，发现miR-568在Jurkat及人CD4~+T淋巴细胞活化后的12h、24h和72h，表达水平都明显降低。给Jurkat或CD4~+T细胞转染miR-568并刺激活化后，流式细胞术检测发现miR-568能明显抑制Jurkat及人CD4~+T淋巴细胞的活化。2) NFAT5是miR-568的直接靶基因，miR-568可能通过NFAT5调节IL-2的表达水平，从而抑制CD4~+T淋巴细胞的活化。我们用靶基因预测软件预测了miR-568的靶基因。用TargetScan和miRanda联合预测到与miR-568的靶基因有5个：NFAT5、CD28、CD3G、CD96和CD69；实时荧光定量PCR和Western blot方法证实miR-568可以下调NFAT5的蛋白水平，但是对其mRNA的表达水平没有影响；双荧光素酶报告基因实验证实miR-568可以结合于NFAT5的3′UTR；ELISA证明miR-568可以下调细胞中IL-2的表达；MTT结果显示miR-568可以抑制CD4~+T淋巴细胞的增殖。3)在体外，miR-568能抑制Treg细胞的活化、增殖和分化，并抑制其分泌效应因子IL-10、TGF-β，降低其免疫抑制功能。经过siRNA介导的NFAT5表达下调实验，我们发现miR-568对CD4~+CD25~+Treg细胞功能的，有可能是通过其靶基因NFAT5实现的。人CD4~+T淋巴细胞受刺激后可以分化成为CD4~+CD25~+Foxp3+Treg细胞，而NFAT家族与Treg细胞密切相关，并且实验证明，miR-568从细胞活化、增殖、分化、细胞因子分泌和免疫抑制功能等几个方面影响了Treg细胞的生物学功能。结论：miR-568是种CD4~+T淋巴细胞活化相关的miRNA，NFAT5是其下游靶基因，miR-568可能通过NFAT5影响IL-2的表达水平，来抑制CD4~+T淋巴细胞的活化；miR-568对Treg的分化和功能有明显的抑制作用，这功能有可能也是通过其靶基因NFAT5实现的。