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黄曲霉毒素B1(Aflatxoni B1,AFB1)是黄曲霉毒素中毒性最强的一种毒素,它的危害性主要表现为强烈的毒性和致癌性,由于它在花生、玉米等食品中广泛存在,因此严重危害了人们的身体健康。在现代社会里,随着人们生活水平的提高,人们日益关注食品安全问题。目前食品安全已引起各国政府的密切关注,欧盟在2000年就提出了世界上安全标准和检验标准,其中AFB1为2μg/kg,总黄曲霉毒素为4μg/kg。
用AFB1-BSA固相化抗原包被酶标板,从Tomlinson单链抗体库中筛选抗AFB1抗体。实验中分别采用甘氨酸洗脱、胰蛋白酶洗脱和游离AFB1竞争洗脱三种不同的洗脱方法对吸附在酶标板上的噬菌体抗体进行特异性洗脱。经过三轮筛选后,随机挑取46个克隆,ELISA检测发现用AFB1竞争洗处理得到的抗体库中46个克隆中有28个阳性克隆,将此28个阳性克隆转化到HB2151可溶性表达,ELISA检测培养基上清全为阴性,反复冻融破碎菌体,取沉淀上清ELISA检测发现5个阳性克隆的沉淀上清呈阳性。采用亲和层析的方法对细胞破碎液进行纯化,通过SDS-PAGE电泳分析,在电泳图上获得一条纯化后的单一条带。竞争性ELISA检测后得到2个能与游离AFB1特异性结合的阳性克隆,抑制率达到50%以上。酶切、PCR和DNA测序鉴定。基因序列测定表明scFv属于人类免疫球蛋白可变区。
为了提高可溶性蛋白的表达量,研究了诱导温度、IPTG浓度和葡萄糖浓度对蛋白表达量的影响,通过对温度、IPTG浓度和葡萄糖浓度优化后,蛋白的表达量有一定的提高。本实验方法可以为其它抗半抗原重组抗体的筛选提供一定的借鉴意义。
用AFB1-BSA固相化抗原包被酶标板,从Tomlinson单链抗体库中筛选抗AFB1抗体。实验中分别采用甘氨酸洗脱、胰蛋白酶洗脱和游离AFB1竞争洗脱三种不同的洗脱方法对吸附在酶标板上的噬菌体抗体进行特异性洗脱。经过三轮筛选后,随机挑取46个克隆,ELISA检测发现用AFB1竞争洗处理得到的抗体库中46个克隆中有28个阳性克隆,将此28个阳性克隆转化到HB2151可溶性表达,ELISA检测培养基上清全为阴性,反复冻融破碎菌体,取沉淀上清ELISA检测发现5个阳性克隆的沉淀上清呈阳性。采用亲和层析的方法对细胞破碎液进行纯化,通过SDS-PAGE电泳分析,在电泳图上获得一条纯化后的单一条带。竞争性ELISA检测后得到2个能与游离AFB1特异性结合的阳性克隆,抑制率达到50%以上。酶切、PCR和DNA测序鉴定。基因序列测定表明scFv属于人类免疫球蛋白可变区。
为了提高可溶性蛋白的表达量,研究了诱导温度、IPTG浓度和葡萄糖浓度对蛋白表达量的影响,通过对温度、IPTG浓度和葡萄糖浓度优化后,蛋白的表达量有一定的提高。本实验方法可以为其它抗半抗原重组抗体的筛选提供一定的借鉴意义。