研究背景慢性鼻-鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是鼻黏膜常见的慢性炎症性疾病,约 30%的 CRS 患者合并有鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)的发生。CRSwNP的发生和发展不仅严重降低患者的生活质量,还给患者家庭和社会造成一定的经济和医疗负担。目前,由于对疾病的发生发展缺乏全面的了解和缺乏精准有效的治疗措施,使CRSwNP的发病具有长期性和反复性,部分为难治性鼻窦炎。转录组测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)是基于测序平台,对特定的组织和细胞转录的mRNA进行的研究,是一种无偏移的探究转录组基因功能和基因结构、识别细胞和分子通路的方法,对生物个体的生长发育过程和疾病发生发展机制的研究具有重要意义。现阶段,RNA-seq技术已经成为进行转录组相关研究必不可少的方法,可对疾病的发病机制进行更精确的探究,从基因水平揭示疾病的发病机制,对疾病治疗关键靶点的发现大有裨益。目前,关于CRSwNP基因表达模式的研究相对较少,导致在基因水平上,对CRSwNP的发病机制缺乏全面和深入的认识。主要原因为:(1)在对CRSwNP进行研究的对照组的筛选上存在干扰因素。例如,CRSwNP和来自健康受试者的对照组织[如下鼻甲(Inferior turbinate,IT)等]之间的基因表达模式的差异可能源于遗传因素,也可能源于环境因素,或两者兼而有之。(2)多数的基因本体(Gene Ontology,GO)分析方法关注的重点在组织间的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),而不是疾病相关的基因集或通路分析。(3)多数基因测序研究仅使用非常有限的样本数量,也在一定程度上限制了基因分析的效力。因此,本研究对大样本的CRSwNP和对照组组织进行全转录组基因表达谱分析,以探究CRSwNP发病的基因谱以及其发生发展的潜在机制。研究方法我们对44例CRSwNP患者的鼻息肉组织(CRSwNP-NP)、下鼻甲组织(CRSwNP-IT)和 41 例对照组的下鼻甲组织(Inferior turbinate in control subjects,CS-IT)进行全转录组RNA测序。通过比较不同来源的三组样本(A.CS-IT—对照组;B.CRSwNP-IT—疾病对照组;C.(CRSwNP-NP—疾病组),最大限度的减少遗传因素和环境因素相互作用而产生的假阳性结果。研究通过STAR将HiSeq FASTQ文件比对到人类参考基因组hg38,使用R version 3.3.3 进行主成分分析(Principal component analysis,PCA),基因表达量以每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数(Reads Per Kilobase Million,RPKM)的log2值来评估样本间的组间差异。对log2 RPKM四分位间距>0.5的数据文件采用edgeR对组间DEGs进行分析。韦恩图用以展现组间比较差异基因的表达和重叠。BioConductor TopGO包对DEGs分析所筛选出的基因列表进行GO分析,确定其富集的生物过程和蛋白质功能。使用IPA软件对DEGs进行功能分析,筛选显著性通路的相关基因集。BioConductor TopGO包进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA),通过分子标签数据库来确定所富集的基因集。研究结果全转录组水平的主成分分析显示,CRSwNP患者和对照组间最主要的差异基因集中在与纤毛功能和免疫调节相关的基因上。PC1主要为调节纤毛生成和纤毛功能的基因,包括纤毛装配、超微结构装配、纤毛运动、纤毛内转运等相关的基因,而PC2主要为炎症和免疫反应的调节基因(先天性和适应性免疫反应、T细胞增殖和协同刺激)、胶原和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)代谢(胶原复合物、ECM结构的组成);CRSwNP-NP和CS-IT组间有6,182个DEGs,这些DEGs的GO富集分析显示基因主要参与胶原加工和组织、炎症反应和O-糖原加工等过程;CRSwNP-IT和CS-IT组间有915个DEGs,对这些DEGs进行GO富集分析,结果显示基因主要富集在干扰素信号通路和病毒应答相关通路;过敏状态对组间基因表达无显著影响;IPA通路分析显示,相对于CS-IT组,CRSwNP(CRSwNP-NP和CRSwNP-IT)组在1型干扰素信号通路、轴突导向经典通路、血管生成、胶原和纤维化改变等基因方面存在明显富集。轴突导向信号是CRSwNP-NP、CRSwNP-IT和CS-IT间的共同通路;GSEA分析显示基因主要富集于炎症反应和细胞异常分化相关的基因集。研究结论CRSwNP的发生发展与宿主防御缺陷、炎症和细胞外基质代谢异常的基因表达相关:(1)纤毛结构与功能相关的基因和免疫调节相关的基因在鼻黏膜组织中表达差异显著。(2)CRSwNP的发病机制与气道重塑和病毒反应密切相关。(3)过度的炎症反应和上皮增生可能为NP发生和发展的重要诱因,轴突导向信号通路可能为NP治疗的关键靶点。(4)炎症和异常细胞分化是早期NP形成的基础。这些基因表达的功能验证将为CRSwNP治疗干预措施(如生物靶向制剂和免疫调节剂的应用等)提供新的可能性。研究背景鼻息肉(Nasalpolyp,NP)是耳鼻喉科常见的慢性上呼吸道炎性疾病,常与哮喘等下呼吸道疾病并存。在亚洲人群中,NP的病理特征主要为上皮重塑和混合型炎性浸润。生理状态下,呼吸道纤毛对进入呼吸道内的病原体和过敏原具有清除作用。我们前期研究己经证实,在NP异常重塑的上皮中,存在基底细胞增殖不良,纤毛生成标记物上调。此外,基于纤毛形态和结构的研究发现,在NP中纤毛密度和长度增加、排列紊乱、动力蛋白轴突重链5(Dynein Axonemal Heavy Chain 5,DNAH5)易位表达以及纤毛摆动频率(Ciliary beat frequency,CBF)显著下降。因此,异常的纤毛生成过程和/或异常的纤毛超微结构可能是导致NP患者黏液纤毛清除率(Mucociliary clearance,MCC)下降的关键因素,从而导致NP中炎症的持续存在。生理情况下,纤毛的运动主要由外动力臂和辐条(Radial Spoke,RS)复合体等结构共同调节。纤毛超微结构在轴突进行装配,而纤毛的分化和生成过程对轴突的正确形成至关重要,是保证纤毛正常功能的前提。中心体蛋白1 10(Centrosomal protein 110,CP110)具有调节纤毛中心体复制和中心体向基体转化的作用。炎症介导的CP110上调会导致慢性鼻-鼻窦炎(Chronic Rhinosinusitis,CRS)患者的鼻黏膜上皮纤毛的装配异常和运动性下降。另外,叉头框蛋白J1(Fork-head box protein J1,FOXJ1)染色阳性的细胞数的增加与NP中纤毛的长度和密度密切相关。总之,CP110和FOXJ1的异常表达可能是NP上皮纤毛生成及装配过程异常的重要因素。目前,关于呼吸道纤毛的文献大多集中在纤毛形态、纤毛生成过程以及纤毛运动等方面,而针对纤毛超微结构异常(如DNAH5)的研究大多针对原发性疾病进行。而各种慢性炎症性疾病导致的继发性纤毛运动障碍(Secondary ciliary dyskinesia,SCD)尚缺乏文献报道。我们推测在NP中,慢性炎症环境可能导致其纤毛生成过程异常和纤毛超微结构异常。因此,在既往研究的基础上,我们系统的分析了 4种常见的纤毛超微结构(RSPH1、RSPH4A、RSPH9和DNAH5)和2种纤毛生成标记物(CP110和FOXJ1)在纤毛损伤中的表达模式,有助于阐明纤毛发生和纤毛超微结构异常在NP发病中的作用,以及慢性气道炎症是否为纤毛超微结构异常的原因。研究方法临床上获取的97例NP患者的鼻息肉组织和32例单纯鼻中隔偏曲患者的对照下鼻甲组织,经过处理后,进行免疫组化染色、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应、单细胞涂片染色以及鼻黏膜上皮干细胞培养。进而对纤毛的超微结构标记物(RSPH1、RSPH4A、RSPH9和DNAH5)和纤毛生成标记物(CP110和FOXJ1)的定量和定位表达进行检测,在前期研究基础上,根据免疫荧光双染的结果,对超微结构标记物的表达模式进行分型,A型:标记物在整个纤毛完整表达;B型:标记物在纤毛远端部分缺失。C型:标记物在整个纤毛完全缺失。为评估纤毛超微结构标志物异常的程度,我们采用半定量评分系统,其中0分表示A型>70%,1分表示A型+B型>70%,2分表示C型≥30%,以此评分系统来定量评估纤毛超微结构双染的共定位表达情况。进而探究纤毛超微结构相关标记物和与CP110和FOXJ1之间的关系。研究结果(1)根据我们的半定量评分系统,在对照组组织的石蜡切片中RSPH1,RSPH4A,RSPH9,DNAH5的定位表达的得分中位数分别为0.2(0.2,0.5)、0.2(0,0.6)、0.2(0,0.8)和0.4(0.2,0.7)。与对照组相比,NP组患者的得分中位数显著高于对照组(全部p<0.001),两组样本中,四种结构蛋白RSPH1、RSPH4A、RSPH9和DNAH5的表达模式的评分间均呈正相关。在嗜酸性粒细胞型NP中得分中位数显著高于非嗜酸性粒细胞型NP。(2)在NP组的单细胞涂片中,A-C表达模式:RSPH1的比例分别为50.0%、22.0%和 28.0%,RSPH4A 的比例分别为 58.0%、12.0%和 30.0%,RSPH9 的比例分别为 48.0%、18.0%和 34.0%,DNAH5 的比例分别为 51.5%、13.5%和 35.0%。对照组A-C的表达模式的百分比:RSPH1为72.0%、18.0%和10.0%,RSPH4A为 88.0%、6.0%和 6.0%,RSPH9 为 72.0%、12.0%和 16.0%,DNAH5 为 74.0%、14.0%和 12.0%(均p<0.05)。(3)NP组中CP110染色呈弥漫厚染,而对照组染色呈局部薄染,纤毛生成标记物FOXJI在纤毛和非纤毛上皮细胞的细胞核内染色。NP组中CP110总荧光强度[1.3(1.1,1.6)VS 0.7(0.5,0.9)×106,p<0.01]和 FOXJ1 总荧光强度[2.7(2.1,3.7)vs.1.7(1.3,2.1)×106,p<0.01]显著高于对照组,且与RSPH1、RSPH4A、RSPH9和DNAH5的表达模式评分呈正相关。研究结论在NP中,RSPH1、RSPH4A、RSPH9和DNAH5异常定位定量表达的发生率较对照组增高,这可能与纤毛生成标记物(CP110和FOXJ1)的异常、慢性炎症环境以及纤毛长度的增加有关。异常的纤毛生成过程导致的纤毛超微结构缺陷可能是影响NP发生发展的重要原因。鉴于NP患者慢性炎症的持续状态和术后高复发率,恢复纤毛结构和功能应作为NP患者的重要治疗方向,进而阻断鼻黏膜中慢性炎症状态和纤毛功能异常间的恶性循环。研究背景哮喘是一种常见的下呼吸道炎性疾病,常与上呼吸道疾病并存。部分重症哮喘(Severe asthma,SA)患者尽管接受了标准化治疗,但症状仍得不到良好控制,病情的频繁恶化和住院治疗需求的增加,给社会和个人造成巨大的医疗和经济负担。呼吸道上皮是抵御病原体、异种生物和空气过敏原侵害的重要屏障。当此屏障被破坏时,警报素(胸腺间质淋巴细胞生成素、白介素-33和白介素-25等)可激活T1或T2信号通路,导致组织中中性粒细胞或嗜酸性粒细胞浸润,此为哮喘的主要病理特征。除了炎症和气道重塑外,黏液纤毛清除障碍在调节哮喘的发病过程中可能具有同样重要的作用。生理情况下,纤毛在向前运动时与气道黏液层接触,向后运动时在黏液层下层通过,从而使气道黏液向前运动。单纤毛细胞的纤毛摆动方向具有随机性,但当与其他纤毛细胞一起时,会产生同向协同摆动模式。黏液纤毛清除功能受损时,纤毛运动呈现非同步性摆动模式,而这种非同步性摆动模式可能源于纤毛超微结构的异常。纤毛超微结构异常的原因可能与遗传性因素,和/或与慢性气道炎症相关的继发性因素相关。黏液纤毛清除功能受损与哮喘的持续性和严重性密切相关,引起气道疾病的过敏原、病原体和异种生物的清除障碍,从而使患者更易感染或过敏。因此,对黏液纤毛清除受损的研究可以使人们更好地了解上下气道在哮喘持续性和严重性上的相互作用。鉴于“同一气道,同一疾病“的理念基础,我们推测在哮喘的严重程度、上呼吸道疾病的合并状态和气道炎症内表型评估的基础上,与动纤毛异常(Motile ciliary disorders,MCD)的评估相结合,可以对哮喘进行更系统更精准的评估,但鼻黏膜上皮纤毛异常是否与哮喘相关尚不清楚。研究方法本研究共纳入41例哮喘患者(33例重度哮喘患者,8例轻中度哮喘患者)和10例健康对照者,对所有研究参与者进行鼻黏膜刷检细胞涂片,详细记录所有参与者的吸烟史、用药情况、过敏情况和上下呼吸道合并疾病情况(如哮喘、过敏性鼻炎和/或慢性鼻-鼻窦炎伴或不伴鼻息肉)。进行上气道指标评估:进行苏木素-伊红染色(Hematoxlin-eosin,HE)和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)对上气道的炎性状态进行评估,进行鼻黏膜上皮动力蛋白轴突重链 5(Dynein axonemal heavy chain 5,DNAH5)和中间链 1(Dynein axonemal intermediate chain 1,DNAI1)的免疫荧光双染,明确鼻黏膜上皮纤毛中DNAH5和DNAI1的表达模式。下气道指标评估:哮喘患者的诱导痰涂片进行HE和IHC染色对上气道的炎性状态进行评估,通过肺功能检查对哮喘患者的肺功能状态进行评估。综合以上指标,分析哮喘中与MCD相关的临床特征,并结合MCD的信息来系统地对哮喘进行评估。研究结果(1)哮喘患者中,伴有过敏性鼻炎和慢性鼻-鼻窦炎的患者分别占61.0%和80.5%。33例伴有慢性鼻-鼻窦炎的哮喘患者中,24例伴有鼻息肉。只有3例哮喘患者(7.3%)既无过敏性鼻炎也无慢性鼻-鼻窦炎。(2)哮喘患者痰中和鼻黏膜刷检样本中炎性类型存在差异,重症哮喘患者痰中以嗜酸粒细胞增多为主,而鼻黏膜刷检中以中性粒细胞浸润居多。(3)与健康受试者相比,哮喘患者鼻黏膜刷检细胞涂片的免疫荧光染色的DNAH5和DNAI1的异常表达模式更为常见(均p<0.05),但非重症哮喘和重症哮喘患者DNAH5和DNAI1的异常表达模式之间无统计学差异(均p>0.05)。(4)与正常对照组相比,34.8%的哮喘患者(包括无上呼吸道疾病的患者)有双标记物的异常表达模式。(5)合并有上呼吸道疾病的重症哮喘患者的纤毛标志物异常表达模式的患病率高于无上呼吸道疾病的哮喘患者。同样,伴有上呼吸道疾病的轻中度哮喘较不伴有上呼吸道疾病的患者纤毛标记物的异常表达率增高。研究结论哮喘是一种异质性疾病,该研究表明哮喘的疾病特征为:(1)哮喘患者上呼吸道疾病(过敏性鼻炎、慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉等)的发生率较高;(2)上下气道炎症表型存在显著的差异,不能单独以上呼吸道的炎症表型来评估哮喘的炎症状态;(3)无上呼吸道疾病的哮喘患者中MCD的患病率高于健康对照组;(4)伴有上呼吸道疾病的哮喘患者MCD的发生率比不伴有上呼吸道疾病的高。因此,上呼吸道纤毛超微结构异常是哮喘的一个显著特征,上呼吸道纤毛超微结构状态的评估,为进一步探究的哮喘的发病机制提供重要的补充。