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研究背景骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨强度下降和骨折风险增加为主要特征的慢性全身性骨代谢疾病。糖尿病(diabetes mellitus,DM)合并骨质疏松症(diabetic osteoporosis,DOP)是继发性骨质疏松症的一种常见病因,有研究表明,1 型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)和 2 型糖尿病(Type 2 diabetesmullitus,T2DM)患者骨折风险增加。糖尿病导致骨脆性增加的机制复杂,其中成骨细胞(osteoblast,OB)功能障碍处于骨代谢异常的核心环节,因此深入探讨高血糖对OB的损伤作用及其病理生理机制对防治OP具有重要的理论意义和临床意义。研究目的(1)探讨焦亡(pyroptosis)在介导高糖(high glucose,HG)引起的小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1细胞)炎症和损伤中的作用;(2)坏死性凋亡(necroptosis)和COX-2(cyclooxygenase-2)通路是否共同介导高糖引起的小鼠MC3T3-E1细胞炎症和损伤。实验方法1.细胞计数检测试剂盒-8(CCK-8)检测MC3T3-E1细胞存活率;2.Western blot法检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白-3(NLRP3)、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、受体相互蛋白1(RIP1)、受体相互蛋白3(RIP3)、环氧化酶-2(COX-2)等蛋白的表达水平;3.采用小干扰RNA(siRNA)细胞转染技术沉默Caspase-1基因;4.酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞上清液相关炎症因子白介素-18(IL-18)和白介素-1β(IL-1β)的分泌水平;5.双氯荧光素(DCFH-DA)染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平;6.罗丹明123(Rh123)染色法检测细胞线粒体膜电位(MMP);7.碱性磷酸酶(ALP)测试盒检测ALP活性;8.茜素红染色法检测钙化结节;9.采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析,计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表述,组间比较用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)统计,两两比较运用最小显著性差异[leastsignificantdifference(LSD)-t test]检验方法,以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果一、焦亡介导高糖引起的小鼠MC3T3-E1细胞炎症和损伤1.高糖(45 mmol/L,HG)上调 MC3T3-E1 细胞 NLRP3 和 Caspase-1 的表达水平;2.沉默Caspase-1基因减少HG引起的MC3T3-E1细胞炎症因子(IL-18和IL-1β)分泌;3.沉默Caspase-1基因抑制HG引起的MC3T3-E1细胞毒性(细胞存活率降低);4.沉默Caspase-1基因沉默抑制HG引起的MC3T3-E1细胞ROS生成增多;5.沉默Caspase-1基因抑制HG引起的MC3T3-E1细胞MMP丢失;6.沉默Caspase-1基因减轻HG对MC3T3-E1细胞ALP活性的抑制;7.沉默Caspase-1基因可对抗HG引起的MC3T3-E1细胞矿化结节数量减少。二、坏死性凋亡与COX-2通路相互作用介导高糖引起的小鼠MC3T3-E1细胞炎症和损伤1.HG上调小鼠MC3T3-E1细胞RIP1和RIP3的表达水平;2.HG上调小鼠MC3T3-E1细胞COX-2的表达水平;3.坏死性凋亡抑制剂(Nec-1)和COX-2抑制剂(NS-398)对抗HG引起的MC3T3-E1细胞存活率降低;4.Nec-1和NS-398减少HG引起的MC3T3-E1细胞炎症因子分泌;5.Nec-1和NS-398对抗HG引起的MC3T3-E1细胞ROS生成增多;6.Nec-1和NS-398对抗HG引起的MC3T3-E1细胞MMP丢失;7.Nec-1和NS-398减轻HG对MC3T3-E1细胞ALP活性的抑制;8.Nec-1和NS-398对抗HG引起的MC3T3-E1细胞矿化结节数量减少;9.坏死性凋亡与COX-2通路之间存在正反馈调节9.1坏死性凋亡抑制剂Nec-1抑制HG对MC3T3-E1细胞COX-2蛋白表达上调作用;9.2 COX-2抑制剂NS-398抑制HG对MC3T3-E1细胞RIP1和RIP3蛋白表达的上调作用。结论1.高糖引起小鼠胚胎成骨细胞炎症和损伤;2.焦亡介导高糖引起的小鼠胚胎成骨细胞炎症和损伤;3.坏死性凋亡与COX-2通路相互作用介导高糖引起的小鼠胚胎成骨细胞炎症和损伤。