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本试验以海南分离株罗非鱼源无乳链球菌基因组DNA为模板,克隆并原核表达α-烯醇化酶蛋白,并应用生物信息学对其氨基酸序列进行分析。通过α-烯醇化酶活力,纤溶酶原绑定活力确定表达重组蛋白具有活性。探究α-烯醇化酶在无乳链球菌的定位和α-烯醇化酶粘附EPC细胞的性质,初步确定其作为亚单位候选疫苗的可能性。用表达的重组蛋白作为抗原,进行小鼠体内免疫试验,探究其对小鼠的免疫保护率。通过本试验,拟对无乳链球菌α-烯醇化酶生物学特性有进一步了解,并为制备具有交叉保护力的抗无乳链球菌亚单位疫苗提供数据基础。首先,对无乳链球菌α-烯醇化酶进行克隆,成功获得含阳性质粒pMD19-T-α-Eno的克隆载体。并利用生物信息学软件对克隆的α-烯醇化酶的氨基酸序列进行分析。结果显示无乳链球菌α-烯醇化酶氨基酸序列含一个烯醇化酶样结构域,不含跨膜区,且没有信号肽序列,是一个疏水蛋白。选取10种不同的致病链球菌以及4株无乳链球菌分离株的α-烯醇化酶氨基酸序列建立系统发育树,发现在检测的10种链球菌之间以及4株无乳链球菌分离株之间,α-烯醇化酶具有较高的同源性。对比无乳链球菌α-烯醇化酶氨基酸序列与海豚链球菌、肺炎链球菌以及化脓链球菌α-烯醇化酶氨基酸序列,发现无乳链球菌a-烯醇化酶C端有决定纤溶酶原绑定的序列FYDAERKVY。将含粘性末端的目的序列连接至表达质粒pET32a(+)中,并转化入表达载体BL21 (DE3),成功构建表达质粒,对目的蛋白进行原核表达,并优化表达条件。结果表明,无乳链球菌α-烯醇化酶重组蛋白大小为67.2KDa最佳表达条件为37℃诱导表达3h, IPTG浓度为0.2mmol/L。利用表达质粒中的组氨酸与咪唑的高亲和力,亲和层析纯化目的蛋白,并用梯度尿素进行复性,得到活性蛋白。将制备的纯化蛋白进行生物学活性分析。纯化后的蛋白具有烯醇化酶的活性,能将磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。蛋白质免疫印迹检测到重组α-烯醇化酶绑定人纤溶酶原的活力。兔抗α-烯醇化酶血清经Western-blot和琼脂扩散试验检测,重组α-烯醇化酶具有良好的免疫原性,制备的抗体效价为1：16。利用制备的抗体进行了α-烯醇化酶细胞表面定位以及细胞粘附试验。流式细胞试验和蛋白质免疫印迹试验检测α-烯醇化酶位于无乳链球菌菌体表面。此外粘附试验结果表明,α-烯醇化酶能粘附EPC细胞,且与抗α-烯醇化酶抗体预孵育过后,无乳链球菌对EPC细胞的粘附率是未与抗体孵育的31.98%。