随着我国养猪业蓬勃发展,各地区向规模化养殖转型是必然趋势。但同时也导致养殖密度以及集中度的扩大。这些变化使得疾病的呈现越发复杂,混合感染以及继发感染的现象越发严重。轮状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒是导致我国规模化养猪业产生仔猪腹泻症状的三种极为常见的病毒性疾病。由于本实验室前期建立的检测三种仔猪病毒性腹泻共检芯片存在点制过程不稳定、杂交效果不理想等特点,综合上述情况,建立一种着实有效、稳定可靠且能平行诊断轮状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒集成芯片的共检方法具有相当重要的意义。本研究主要针对以下几点进行共检芯片的质量控制：1、联合共检仔猪病毒性腹泻基因芯片的制备质量控制本研究对芯片点制过程进行了相关条件优化,芯片质量的控制主要优化了以下条件：点样液及其混合比例本试验确定了点样液的选择和探针的最佳点样浓度,通过对比博奥和百傲公司生产的两种点样液,以及两种点样液的最佳混合比例,结果表明两者比例为1：1时探针样点大小符合扫描条件；探针的最佳点样浓度通过将PM探针稀释至一定浓度后,分别杂交后,确定了探针的最佳点样浓度为600ng/μL。点样后处理最佳条件本试验确定了探针点样的后处理最佳条件。试验采用接触式点样将探针点制在氨基玻片以后,通过对比不同的水合时间,洗液的选择及干燥方式,确定点制后为：60-80℃温水水合4s,紫外交联30min,80℃烘干8h,0.2%的SDS洗液清洗后,立即离心干燥,真空保存备用。本研究成功实现了对芯片制备质量的控制,制备的芯片具有点制出的阵点大小均匀、初始背景值低、杂交后信号值高等特点。为联合共检病毒性腹泻疫病提供了质量稳定、使用可靠的基因芯片。为后续的靶基因杂交条件优化与应用检测打下了基础。2、联合共检仔猪病毒性腹泻基因芯片杂交技术优化本研究对靶基因杂交过程进行了相关条件优化,杂交过程的质量控制主要优化了以下条件：引物标记方式的选择本试验确定了靶基因标记方式的选择,通过对比引物直接标记和C碱基间接标记两种方法,结果表明使用用5’端修饰Cy3的引物标记的靶基因杂交后的杂交效率和信号值均高于Cy3-dCTP标记的靶基因。不对称PCR扩增靶基因的最佳浓度选择本试验确定了靶基因扩增方式的选择,以不同正反向引物比例的不对称PCR扩增与常规PCR扩增方式对比,最终采取1：40比例的不对称PCR作为靶基因的扩增方式。介于不对称PCR扩增靶基因的最佳杂交温度和最佳杂交时间选择本试验确定了基于不对称PCR扩增靶基因的最佳杂交温度和最佳杂交时间。通过以一定梯度杂交时间和一定梯度的杂交温度分别进行杂交扫描分析。从而确定靶基因以48℃,杂交3h作为该共检芯片最佳条件。本研究通过对靶基因相关杂交条件的优化,确定了芯片杂交过程中的各个最优环节、提高了该共检芯片的杂交效率,使其具有杂交后信号值高且稳定的效果。为后续的检测技术研究打下了基础。3、联合共检仔猪病毒性腹泻基因芯片技术应用本研究通过对该共检芯片进行相关质量评价,并利用该技术对来自四川地区具有腹泻症状的仔猪进行了检测。共检芯片的特异性、灵敏性、重复性本试验通过全探针杂交方式对该共检芯片的特异性,灵敏性,重复性三个方面进性考量。与PoRV、TGEV、PEDV、 PRRSV+CSFV+JEV+PRV杂交表明芯片有较好的特异性；灵敏性实验表敏该检测芯片的最低检测浓度为105copies/μL;随机抽取5张同批次芯片检测,表明该检测方法稳定可靠；单张芯片最多可重发检测7次；对不同RNA抽取试剂盒做出了筛选,并对已知检测结果的病料进行了芯片检测验证。共检芯片对四川部分地区的临床检测本试验对来自绵阳、阿坝、彭州、资阳、眉山、广安、攀枝花、巴中的56份有腹泻症状仔猪小肠组织进行了芯片检测和常规RT-PCR检测,其符合率为95%,并随机抽取了其中22份病料的小肠内容物及粪便进行检测,检出率低于小肠组织的检测。对来自四川地区的56份病料检测结果表明,三种病毒阳性感染率为77%,且以PEDV单独感染为主,病毒阳性感染率为66%。通过对该共检芯片的质量评价,表明本研究成功建立了能同时共检三种仔猪病毒性腹泻共检芯片的检测方法,且使用该方法进行芯片检测时具有杂交效果稳定、且杂交效率高的特点；本研究证明了猪流行性腹泻病毒在四川地区的30d以下的仔猪中存在严重感染。