紫杉醇作为一种高效、低毒、广谱的抗癌药物,供不应求,合成生物学为解决紫杉醇类药物的供求矛盾提供了新的契机。但紫杉醇合成途径中的多个羟化酶基因因为底物匮乏尚未确定,限制了利用合成生物学生产紫杉醇的进展。本研究拟在真核模式生物酿酒酵母中构建紫杉醇合成前体紫杉二烯的合成通路,为后续羟化酶的研究提供底物,进而加速利用合成生物学生产紫杉醇的进程。取得的主要结果如下:(1)克隆了在酿酒酵母中异源构筑紫杉二烯通路所需的基因。这些基因包括酵母內源的thmgr、erg20、bts1、upc2.1和来源于中国红豆杉的ggpps、tTS、hmgr、fpps,以及相关的真核启动子tef1p、tdh3p以及终止子cyc1t。同时对所扩到基因编码的蛋白质进行了理化性质分析和保守结构域分析。(2)构建了紫杉二烯合成通路的各个基因的表达载体和5株拟能够产紫杉二烯的酿酒酵母工程菌。采用模块导入方式,各个基因分别位于独立的表达盒中,含有单独的启动子和终止子。酵母内源基因模块采用整合质粒、外源基因模块采用游离质粒,通过各个基因的组合表达构建了5株工程菌,并分别通过PCR验证、荧光定量和Western blot验证了基因的转入和表达。(3)工程菌的发酵特征分析。比较分析了5株工程菌与对照菌株WAT11的生长及产物合成情况,结果发现:各个工程菌生长稳定期都较长,有利于次生代谢产物合成的积累;紫杉二烯下游合成模块对工程菌的生长有一定的抑制作用,而提高上游tHMGR的表达,可以使工程菌生长抑制情况得到改善;模块转入使角鲨烯产量大大提高,并且对角鲨烯支流进行抑制有益于目标产物紫杉二烯的合成。综上,本研究成功克隆了在酿酒酵母中构建紫杉二烯通路所需要的酶基因、启动子、终止子、转录因子等,并构建了5株基因工程菌,虽然目标产物的合成路径有待进一步优化,但是工程菌的构建仍旧为酿酒酵母中紫杉二烯通路的构建奠定了基础。