基于PI3K/AKT信号通路探讨肾消通络方对糖尿病db/db小鼠肾脏保护机制

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目的:检测血管内皮细胞标记物CD31的表达,观察db/db小鼠肾小球内皮细胞增殖和血管新生情况及肾消通络方的干预作用;观察PI3K/AK T/VEGF信号通路的激活情况,探讨肾消通络方的可能作用机制,为临床应用中药提供实验依据。方法:本实验采用自发性2型糖尿病db/db小鼠为DKD模型,将30只db/db小鼠随机分为模型组(Model)、肾消通络组(SXTL)及坎地沙坦组(KDST),10只同源不发病db/m小鼠作为正常对照组(Control)。治疗组分别给予肾消通络方29.5g·kg-1·d-1和坎地沙坦1.33mg·kg-1·d-1灌胃给药,対照组和模型组则每日给予等容量的蒸馏水。在给药前和给药第4、8周称小鼠体质量及测血糖。给药第8周末,收集24h尿液,检测24h尿蛋白含量。取血检测肌酐(Serum creatinine,Scr)及尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)。取肾组织,一侧置于4%多聚甲醛中固定行常规HE及PAS染色,观察各组小鼠肾脏的病理改变,免疫组织化学检测CD31,且对CD31进行半定量分析,并分析24h尿蛋白含量与CD31表达的相关性。另一侧肾脏置于-80℃冰箱中保存,采用Western blot方法检测肾组织中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。结果:1.一般情况与対照组相比,模型组小鼠明显的表现出多饮、多食、多尿及体型肥胖等症状。正常组因灌胃死亡2只,模型组、肾消通络组、坎地沙坦组各死亡2只。2.体质量比较与対照组相比,模型组小鼠体质量增加(P<0.01),与模型组比较,肾消通络组、坎地沙坦组的体质量均降低(P<0.05)。3.血糖、肾功能及24h尿蛋白含量的比较与对照组相比,模型组小鼠血糖升高(P<0.01),与模型组比较,肾消通络组、坎地沙坦组小鼠血糖差异无统计学意义。与对照组相比,模型组小鼠血清Scr、BUN含量及24h尿蛋白含量显著增高(P<0.01);与模型组比较,肾消通络组、坎地沙坦组的血清Scr、BUN含量及24h尿蛋白含量均明显降低(P<0.05)。4.肾脏病理形态学改变HE染色:对照组肾小球结构清晰无明显异常;模型组肾小球内细胞数增多,肾小球肥大;与模型组相比,肾消通络组及坎地沙坦组病理改变减轻,但两组间差异不明显。PAS染色:对照组肾小球结构无明显异常;模型组肾小球基底膜增厚,细胞外基质积聚,系膜增生;与模型组相比,肾消通络组及坎地沙坦组病理改变减轻。5.免疫组化检测肾小球CD31的表达及半定量分析与对照组相比,模型组小鼠肾小球CD31表达显著增高(P<0.01);与模型组比较,肾消通络组、坎地沙坦组小鼠肾小球CD31的表达均明显降低(P<0.05)。6.CD31的表达与24h尿蛋白相关性分析相关性分析结果显示,CD31表达与24h尿蛋白呈正相关。7.Western Blot检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGF的表达Western blot结果显示:与对照组相比,模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/A KT/AKT、VEGF等蛋白表达显著增强(P<0.01),经肾消通络方及坎地沙坦治疗后,与模型组相比,治疗组表达下调,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.肾消通络方可改善db/db小鼠的一般状况,减少24h尿蛋白含量,降低Scr及BUN水平,改善肾功能。2.肾消通络方可减轻db/db小鼠肾脏的病理损伤。3.肾消通络方可抑制CD31的表达,抑制内皮细胞增殖和血管新生。4.肾消通络方可抑制PI3K/AKT/VEGF信号通路的活化,可能是其抑制肾小球内皮细胞增殖和血管新生的潜在机制。
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