【摘 要】
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抗生素的广泛使用导致沙门氏菌的耐药问题日趋严重,给人类和动物健康带来极大威胁。长期以来,大量学者以及政府部门对食源性沙门氏菌的药敏性、耐药菌株携带的编码基因做了广泛的调查和监测,然而仍缺乏在耐药基因检测中用作参比的标准样品。为了更好、更快、更精准地了解介导食源性致病菌携带的耐药基因和相关耐药机制,检测过程标准菌株的使用非常必要。本研究将筛选出耐药程度高、耐药基因遗传稳定的沙门氏菌,进而使用这些菌株
【基金项目】
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“十三五”国家重点研发计划重点专项—食品微生物检验相关参考物质体系研究及评价（2017YFC1601400）；
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抗生素的广泛使用导致沙门氏菌的耐药问题日趋严重,给人类和动物健康带来极大威胁。长期以来,大量学者以及政府部门对食源性沙门氏菌的药敏性、耐药菌株携带的编码基因做了广泛的调查和监测,然而仍缺乏在耐药基因检测中用作参比的标准样品。为了更好、更快、更精准地了解介导食源性致病菌携带的耐药基因和相关耐药机制,检测过程标准菌株的使用非常必要。本研究将筛选出耐药程度高、耐药基因遗传稳定的沙门氏菌,进而使用这些菌株制备适于携带β-内酰胺酶类编码基因食源性致病菌检测用参考菌株。开展此类菌株标准样品的研制工作,可实现自主知识产权菌株标准样品在食品耐药微生物标准样品领域的广泛应用,解决国家相关检测中使用参考菌株被国外菌株长期占据的“卡脖子”问题,节省食品中耐药微生物标准样品外汇支出。研究通过革兰氏染色、16S rDNA序列测定、VITEK全自动生化检测系统及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionizer Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF-MS）蛋白质鉴定4种方法对备选菌株进行鉴定,并在国家相关机构备案,申报研制国家标准物质。使用真空冷冻干燥技术制备参考菌株样品,将制备好的样品进行均匀性检验,同时分别存放于37℃ 13 d、4℃ 90 d、-80℃ 360 d监测样品的贮存稳定性、耐药基因及耐药表型的遗传稳定性。选取6家检测人员、试剂、设备、环境、量值溯源等均满足检验能力需求的实验室对制备的部分参考菌株进行联合定值。研究取得的结果如下:1.菌株鉴定、在中国医学细菌保藏中心申报备案和参考菌株研制。基于革兰氏染色、16S rDNA序列测定、VITEK和MALDI-TOF-MS,完成从实验室前期分离的菌株中挑选出具有不同耐药表型和耐药水平的118株沙门氏菌的鉴定,筛选出携带β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因菌株3株（即:1株同时携带blaCTX-M-55和blaTEM-1、1株携带blaCTX-M-3、1株同时携带blaTEM-1、blaOXA-1和blaCTX-M-15）,高度耐药表型菌株5株。118株沙门氏菌均获得中国医学细菌保藏中心CMCC保藏号,经过遗传稳定性试验后,目标基因及耐药性均可稳定遗传;最终,选取具有代表性的8株菌提交国家标准委员会申报参考菌株研制立项。2.8株菌通过真空冷冻干燥技术制备得到参考菌株各500瓶。借助中国检验检疫科学研究院的大型冷冻干燥设备,完成8株参考菌株的制备。制备好的参考菌株使用西林瓶真空包装。3.对8株备选参考菌株携带的特定耐药基因的遗传稳定性、参考菌株的均匀性及贮存稳定性检验结果表明,存放于37℃ 13 d后活菌数在104 CFU/瓶上下浮动、4℃ 90 d后活菌数保持在106 CFU/瓶左右、-80℃ 360 d后活菌数保持在3×106 CFU/瓶左右,且耐药基因和耐药表型在保存过程可稳定遗传,均匀性良好,可作为耐药检测用阳性菌株。4.联合定值反馈结果均与预期结合吻合,研制得到的参考菌株符合参考菌株要求。
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