髓样分化蛋白-2在糖尿病视网膜血管增生中的作用机制研究

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目的:  探讨髓样分化蛋白-2(MD2)对糖尿病视网膜病变发生发展的过程中出现的病理性血管增生这一过程的作用机制,以及MD2小分子抑制剂L6H21(查尔酮类小分子化合物)[1]抑制高糖导致的视网膜炎症内环境中的MD2的介导作用,进而产生抗血管新生作用。项目实施将明确MD2介导的炎症反应在视网膜血管增生中的作用,证实MD2可以作为糖尿病视网膜病变血管增生治疗的新靶点,提供新的治疗策略。  方法:  1.利用1型糖尿病动物模型,探讨L6H21对糖尿病视网膜血管新生及炎症反应的治疗作用,明确MD2可以作为糖尿病视网膜病变血管增生的重要治疗靶点,本实验部分包括:(1)实验分组为野生型C57BL/6小鼠正常对照组,模型组,和治疗组(利用STZ注射造模)。其中,治疗组为STZ注射3个月(通过视网膜电图检测,证实确有DR及视网膜血管增生发生)后开始给药,每日一次,连续给药6个月,并详细记录动物实验时间,监测血糖、体重等指标;(2)被处死前一天分别记录上述眼底检查情况,处死后收集视网膜,视网膜铺片,检测视网膜病变相关病理指标、微血管形态学检测;(3)检测视网膜中炎症因子含量、WB实验考察TLR4/MD2表达量、血管增生相关信号通路等方面的情况。  2.利用人微血管内皮细胞(HMEC-1)探讨L6H21通过抑制MD2对高糖诱导的血管生成信号通路、各种血管生成相关细胞因子表达的影响,并验证MD2在高糖诱导的血管增生中的是作为TLR4的必要配体存在,本部分实验包括:(1)利用RT-PCR技术考察L6H21对高糖刺激的HMEC-1细胞中TGF-β、Collagen-1、Ang-2等血管生成相关因子蛋白和mRNA水平的影响;(2)利用Western blot技术考察L6H21对高糖刺激的HMEC-1细胞中TLR4/MD2表达、NF-κB p65浆-核转移的影响;(3)利用免疫沉淀技术考察高糖刺激下TLR4与MD2的结合程度,TLR4与下游通路MyD88和TRIF的结合程度,以及L6H21对TLR/MD2复合物结合的影响。  3.利用MD-2敲除小鼠验证MD-2在视网膜病理性血管新生过程中的靶点地位。本实验部分包括:(1)实验分组为野生型C57BL/6小鼠正常对照组和模型组,MD-2敲除的C57BL/6小鼠正常对照组和模型组(利用STZ注射造模)。STZ注射造模后3个月,四组小鼠均通过视网膜电图检测,证实造模组确有DR及视网膜血管增生发生而对照组功能及生理结构正常。SPF环境下继续饲养6个月,并监测血糖、体重等指标;(2)被处死前一天分别记录上述眼底检查情况,处死后收集视网膜,视网膜铺片,检测视网膜病变相关病理指标、微血管形态学检测;(3)检测视网膜中血管增生细胞因子含量、WB实验考察TLR4/MD2表达量、血管增生相关信号通路等方面的情况。  结果:  1.糖尿病视网膜病变小鼠视网膜处于炎症环境下,出现了视网膜血管新生的表现及相关蛋白、细胞因子的表达。  2. HMEC-1细胞被高糖刺激后,迁移、成管能力明显被激活,高糖通过促进MD2和TLR4蛋白的结合激活下游MyD88和非MyD88途径(TRIF途径),进一步诱导损伤产生。  3.敲除MD2后的糖尿病小鼠,即使长期处于高血糖状态,因MD2和TLR4的结合未能增加,导致下游通路激活同样发生减低。血管新生现象也被显著抑制。  结论:  1.通过抑制MD2可以降低高糖诱导的血管新生,即MD2介导糖尿病视网膜病变中的血管新生过程。  2. MD2的介导作用,需通过和TLR4结合完成,即MD2有TLR4依赖性。  3. MD2可作为防治视网膜血管新生的新靶点,MD2靶向抑制剂L6H21,可以作为防治视网膜血管新生的新药。
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