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鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性、接触性传染病。以肝脏肿大并伴有出血点,脾脏肿大、角弓反张、走路不稳等为主要特点。当下我国流行的DHV主要是1型鸭甲肝病毒(DHAV-1),也是在世界范围内主要流行的血清型。该病毒引起的DVH给养殖户造成了巨大的经济损失,严重制约了养鸭业的健康发展。由于临床生产中该病发病急,死亡快,而普通实验室检测方法又比较麻烦,耗时长,不利于该病的快速确诊与治疗。为了方便该病在临床生产中的快速诊断,本研究研发了快速检测DHAV-1的胶体金试纸条。本研究共分为三部分。试验一、重组DHAV-1 VP1蛋白的诱导表达及纯化将实验室保存的重组表达DHAV-1 VP1蛋白的质粒pET32a-VP1进行了重新酶切鉴定和测序,再将重组蛋白进行诱导表达和Western blotting鉴定分析。结果表明,DHAV-1的VP1蛋白成功得到了表达,表达蛋白经纯化后浓度为2mg/mL,Western blotting鉴定分析发现该重组蛋白能够与DHAV-1的单克隆抗体4E6反应,具有良好的反应原性。试验二、DHAV-1多克隆抗体及单克隆抗体的制备将试验一诱导表达后纯化的重组蛋白按照每只BALB/c小鼠注射100μg的剂量,每隔两周皮下免疫一次,一共免疫5次,最后一次腹腔注射,用ELISA方法检测多克隆抗体效价。ELISA检测结果表明,随着免疫次数的增加,多克隆抗体的效价前期时呈快速递增趋势,后期逐渐平稳,5免后多抗效价为1:25600。将实验室保存的分泌DHAV-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E6复苏,注射到提前7天腹腔注射石蜡的BALB/c小鼠,10天后采集注射小鼠的腹水,用ELISA方法检测单克隆抗体效价。ELISA检测结果表明,单克隆抗体4E6的效价为1:51200。试验三、检测DHAV-1胶体金试纸条的研制采用柠檬酸三钠还原法制备不同直径大小的胶体金颗粒,调节到最适pH值后,将胶体金颗粒与纯化的抗体发生物理结合,吸附到玻璃纤维素膜上;将纯化的单抗作为捕获抗体,固定于硝酸纤维素膜上,制备胶体金免疫层析检测试纸条,并对最佳工作条件进行了优化。对胶体金试纸条的条件摸索最终确定胶体金标记抗体的最佳浓度为15μg/mL,标记最佳值为18μg/mL,最终确定为包被于NC膜的T线浓度为700μg/mL,包被C线浓度为600μg/mL。对制备的检测DHAV-1的胶体金试纸条进行了特异性、敏感性、重复性和稳定性检测,结果表明制备的胶体金检测试纸条能够与DHAV-1和DHAV-3发生反应,但不与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、新城疫病毒以及阴性对照PBS反应;敏感性试验结果表明,试纸条可以检测到的最低病毒蛋白含量为9.198 ng/μL,灵敏性稍低于双抗体夹心方法;不同批次试纸条对样品的检测结果一致;4℃和25℃条件下保存6个月不影响检测结果。这表明本研究制备的检测DHAV-1的胶体金试纸条具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,由于其可以在5 min内得出检验结果,为DHAV-1的临床诊断提供了一种快速、现场检测的手段。