目的研究NIRF蛋白对HBV核心蛋白的作用及其机制。探索NIRF是否是HBc的一个E3ligase。NIRF是否与HBc在细胞内相互结合,从而导致HBc的泛素化降解。探讨NIRF对HBc表达和HBV复制、分泌的影响。方法1.以pIRES2-EGFP-NIRF为模板,PCR法扩增NIRF基因编码区序列,将其克隆至pCMV-Myc真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-Myc-NIRF。将其转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测NIRF的表达。以pCMV-Core为模板,PCR法扩增HBc基因编码区序列,将其克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pcDNA3-HBc。将其转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测HBc的表达。全基因合成泛素基因序列,构建pcDNA3-UB质粒。2.在HEK293细胞和HepG2.2.15细胞内进行NIRF与HBc的免疫荧光共定位实验。3.在HEK293和HepG2.2.15细胞内进行NIRF与HBc免疫共沉淀实验。研究NIRF与HBc在细胞内的相互作用。4.在HEK293细胞内,进行NIRF导致HBc降解的动力学分析。在HEK293细胞内,进行泛素化研究,确定其降解是否是泛素化降解。5.在HepG2.2.15细胞中,上调或者下调NIRF的表达。用Western blotting的方法观察HBc蛋白水平的变化。用实时荧光PCR技术检测HBV复制和分泌的情况。结果1.重组真核表达质粒pCMV-Myc-NIRF、pcDNA3-HBc和pcDNA3-UB构建正确。2.在HEK293细胞和HepG2.2.15细胞内,NIRF与HBc均存在共定位现象。3.免疫共沉淀实验证实,NIRF能与HBc在细胞内发生相互结合。且加入MG-132后,使得NIRF与HBc的含量升高。4. NIRF在真核细胞内导致HBc降解,且该降解是泛素化降解。5. NIRF上调后,HBc蛋白水平降低,HBV含量下降。NIRF下调后,HBc蛋白水平升高,HBV含量上升。结论成功构建了真核表达质粒pCMV-Myc-NIRF, pcDNA3-HBc和pcDNA3-UB。无论是外源性的NIRF与HBc,还是内源性的NIRF与HBc,在细胞中均存在共定位现象。NIRF是HBc的一个E3ligase。其在细胞内与HBc相互结合,导致HBc的泛素化降解。NIRF是HBc表达的一个负调节子。NIRF在HBV的复制和分泌中起负调节作用。