论文部分内容阅读
背景:脓毒症是全身性炎症反应综合症（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,其反应机制涉及较广,发病机制复杂。近年来,尽管医疗水平不断提高,对脓毒症的研究逐渐深入,脓毒症高致死率的局面仍然未得到扭转。外泌体是细胞外囊泡的重要组成部分之一,其直径大小在30-100 nm,可以通过携带特定的蛋白质、细胞因子及遗传信息等与受体细胞融合,参与细胞间的信息交流。据报道外泌体的数量及内容物在癌症的发病过程会发生相应的改变,与肿瘤的发生发展、癌细胞增殖、浸润及转移密切相关。至于外泌体在脓毒症发生发展过程中的作用,目前尚无相关报道。MicroRNA（miRNA）是一类内源性非编码RNA,具有基因调控的功能,参与有机体的一切生命活动,且与疾病发生密切相关。有报道称外泌体携带的miRNA在体液中稳定存在,不易降解,在临床诊断和预后评估方面的作用突出,逐渐受到研究人员的重视。我们课题组前期研究发现脓毒症患者血清外泌体中的miRNA的表达水平与健康对照相比发生较大改变,这提示我们外泌体中的miRNA可能参与了脓毒症的发病过程。因此,探讨脓毒症不同阶段外泌体中miRNA的变化也许对阐明脓毒症的发病机制具有重要意义。目的:分析脓毒症不同阶段外泌体中miRNA表达水平的变化,并进一步探索差异miRNA的意义。方法:选择2014年10月至2016年12月于广州军区总医院及广东省第二人民医院ICU就诊的脓毒症患者60例为实验组,匹配健康志愿者50例为对照组。按照外泌体提取试剂盒的说明方法提取血清样本中的外泌体,并进行鉴定。采用高通量测序,对外泌体中的小RNA进行生物信息学分析及鉴定,找到脓毒症不同阶段差异表达的miRNA。通过RT-qPCR的方法对这些差异表达的miRNA进行验证。采用受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC曲线）分析单个差异表达的miRNA对脓毒症临床诊断的价值。其次,分析miRNA对不同阶段脓毒症诊断的价值。结果:（1）提取血清中的外泌体,在透射电镜下观察其形态,呈典型的膜型结构;Western blot检测其表面标志蛋白分子CD9、CD63均有表达。（2）miRNA测序法鉴定外泌体携带的miRNA,并通过生物信息学分析计算表达量,我们以|log2（FC）|＞=1及P＜0.05为筛选条件,找到8个在疾病不同阶段表达差异的 miRNA,其中 hsa-miR-454-3p 和 unconservative91297547 在严重脓毒症组中的表达低于其他组,与健康组相比差异具有统计学意义;hsa-miR-4748在脓毒症发展过程中表达量下调,脓毒症休克组表达量与健康组相比存差异具有统计学意义;unconservative12290177在脓毒症组表达上调,而严重脓毒症及脓毒症休克时表达量下调。进一步对差异miRNA的靶基因进行GO分析,结果显示在分子功能方面以分子转运活化和受体激活为主,在细胞组成方面以细胞连接及细胞外间质为主,在生物过程方面以生物黏连、反应应激及信号传递为主。（3）RT-qPCR 对 hsa-miR-454-3p、hsa-miR-4748、unconservative12290177和unconservative91297547进行定量分析,结果显示与健康对照组相比,hsa-miR-454-3p和unconservative91297547在严重脓毒症中表达量下调,差异具有统计学意义;脓毒症休克组中hsa-miR-4748的表达量下调,差异具有统计学意义;unconservative12290177在脓毒症组中的表达显著上调,而严重脓毒症及脓毒症休克时表达量下调。这些结果与测序结果吻合。（4）ROC曲线分析评估外泌体miRNA对脓毒症患者的诊断价值,结果显示Hsa-miR-4748对脓毒症具有中等的诊断价值,（AUC=0.759,CI95%=（0.618-0.901））。进一步评估miRNA在对脓毒症不同阶段的诊断价值,结果显示unconservative91297547和hsa-miR-454-3p对严重脓毒症具有较高的诊断价值,并且联合unconservative91297547和hsa-miR-454-3p能够提高对严重脓毒症的诊断价值（AUC=0.922,CI95%=（0.810-1.000））;hsa-miR-4748 对脓毒症休克的诊断具有中等的诊断价值（AUC=0.797,CI95%=（0.624-0.952））。结论:总的来说,血清外泌体体中的miRNA与脓毒症的不同阶段密切相关,且外泌体中的miRNA能够作为可靠的脓毒症诊断指标。