【摘 要】
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本文意在诱变育种出高产金属硫蛋白酿酒酵母菌株，并对其羟自由基清除能力进行对比研究，为日后金属硫蛋白在清除自由基与促排重金属方面的应用提供了理论支持，同时也为大规模生产金属硫蛋白打下了基础。本文以酿酒酵母31206为出发菌株，采用紫外、微波及NTG三重复合诱变，经过初筛、复筛、再复筛的方法筛选出金属硫蛋白产量较高的一株菌，经15代稳定性遗传表明该突变株稳定性较好，均保持在90%以上。总蛋白含量的测定
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本文意在诱变育种出高产金属硫蛋白酿酒酵母菌株，并对其羟自由基清除能力进行对比研究，为日后金属硫蛋白在清除自由基与促排重金属方面的应用提供了理论支持，同时也为大规模生产金属硫蛋白打下了基础。本文以酿酒酵母31206为出发菌株，采用紫外、微波及NTG三重复合诱变，经过初筛、复筛、再复筛的方法筛选出金属硫蛋白产量较高的一株菌，经15代稳定性遗传表明该突变株稳定性较好，均保持在90%以上。总蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法，金属硫蛋白含量的检测用酶联免疫分析法（ELISA法），巯基活性的检测用简化巯基试剂（DTNB法）。诱变后总蛋白含量由原来的44.6mg/g菌体提高到170.2mg/g菌体，金属硫蛋白含量由原来38.3ng/L提高到163.4ng/L，巯基活性由原来的0.029μmol提高到0.146μmol。对突变株N-8菌株生产Cu-MT的摇瓶发酵条件进行优化，最佳条件为：选择CuCl2为诱导MT试剂，活化培养时间为24h，诱导培养pH为6.5，摇床转速为140r/min，接种量为1mL/50mL培养液，装液量为50mL/250mL三角瓶，诱导培养温度为30℃，诱导培养时间为48h。选取诱导剂浓度，诱导培养时间，诱导培养温度，诱导培养pH四个因素进行响应面实验，求得最佳提取方案为：诱导剂浓度为0.7mmol/L，诱导培养时间为62h，诱导培养pH6.4，诱导培养温度为30℃。在此提取的条件下，测得金属硫蛋白产量为170.91ng/L。通过Sephadex-100凝胶柱分离出粗Cu-MT、DEAE-52离子柱层析分离粗MT三个亚型：MT-Ⅰ，MT-Ⅱ，MT-Ⅲ，后Sephadex-25凝胶柱对蛋白组分进行脱盐，冷冻干燥得到MT纯品。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得MT-Ⅰ，MT-Ⅱ，MT-Ⅲ分子量为7254。实验证实，对比抗坏血酸，金属硫蛋白各个亚型具有很强的羟基清除能力。
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