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CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌抵御外源入侵的一种适应性免疫机制。由于效率高、操作简单及成本较低等特点,该系统在各领域中得到广泛应用,是一种具有广阔应用前景的基因编辑工具。CRISPR/Cas系统分为两类,其中二类系统只需要单个效应蛋白,操作更简单。因此,二类系统引起了科研人员更多的关注。目前已经有两种二类CRISPR/Cas系统:Cas9和Cpf1系统被用于细胞或动植物等个体的基因编辑。C2c1是近年来新发现的一个二类CRISPR/Cas蛋白。已有研究证实它能够断裂靶DNA。目前国内外对C2c1的结构与功能研究很少,C2c1识别sgRNA与靶DNA和剪切靶DNA的作用机制尚不清楚。本研究利用X射线衍射技术及其他分子生物学技术手段,针对BthC2c1蛋白结合sgRNA与ds DNA的三元复合物晶体结构进行解析,并结合体外酶切、MST检测等实验,揭示了BthC2c1识别sgRNA和ds DNA的模式,并对sgRNA介导BthC2c1剪切ds DNA的分子机制进行研究。本研究首先对BthC2c1-sgRNA-dsDNA复合物进行装配与纯化,通过对复合物的结晶初筛、优化及衍射数据的收集与处理,最终解析了复合物结构。结果表明:该复合物由二叶片的结构组成,包含一个REC识别叶和一个NUC核酸酶叶。结构信息结合体外酶切实验揭示了BthC2c1识别ds DNA的分子机制,尤其是BthC2c1对PAM严谨型识别模式。这与Cas9和Cpf1宽松的PAM识别模式不同。sgRNA stem loop1和tetraloop的截去并不影响sgRNA介导BthC2c1在体外剪切DNA的活性。对BthC2c1与Aac C2c1进行了序列比对,BthC2c1和Aac C2c1有33%的序列一致性;将BthC2c1-sgRNA-dsDNA和Aac C2c1-sgRNA-ds DNA复合物的结构进行比对,结果表明BthC2c1和Aac C2c1的整体结构比较保守,识别sgRNA及ds DNA的模式很相似。通过Sanger测序法、酶切实验及MST亲和力检测等方法进一步研究sgRNA介导BthC2c1剪切DNA的分子机制。结果显示:BthC2c1剪切DNA的产物会产生黏性末端;BthC2c1在靶DNA链上的断裂位点位于guide RNA:靶DNA异源双链片段以外的区域,这一点不同于Cas9和Cpf1;检测BthC2c1在不同金属离子存在下的酶切活性发现:Mg2+、Mn2+和Ca2+对BthC2c1活性有增强作用;Zn2+、Ni2+对BthC2c1活性有减弱作用;检测BthC2c1在不同温度下的酶切活性结果表明:BthC2c1在sgRNA的介导下能够在37℃到67℃的温度范围内剪切靶DNA;在27℃没有酶切活性,在32℃活性极弱,在37℃活性仍较弱,在42℃和47℃活性显著增强;BthC2c1在293T细胞、DF-1细胞和小鼠胚胎内没有检测到活性;在25℃、37℃和42℃的MST检测中,随着温度的升高,BthC2c1与底物ds DNA36/36的亲和力增强,在42℃时BthC2c1对ds DNA的亲和力更高,意味着BthC2c1与ds DNA尤其是PAM的结合更加紧密,因此,推测BthC2c1严谨型识别PAM的模式可能是BthC2c1在42℃剪切底物活性更强的原因。BthC2c1-sgRNA-dsDNA复合物结构解析与功能研究,揭示了sgRNA介导的C2c1蛋白识别和剪切ds DNA的分子机制,为改造C2c1蛋白作为新型基因剪辑工具提供实验依据。同时,对进一步认识二类CRISPR/Cas蛋白家族具有重要的科学意义,为更好地开发和应用二类CRISPR/Cas蛋白家族进行基因编辑提供了新思路。