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兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）属于嵌杯病毒科（Caliciviridae）,兔病毒属（Lagovirus）。RHDV引起兔的一种急性、败血性、高度致死性的传染病,该病毒于1984年在我国江苏无锡等地被首次报道。RHDV2是兔出血症病毒的一种亚型,与经典RHDV不同,在自然条件下,RHDV2既能感染野兔,也可感染家兔,而且家兔更为易感,尤其是幼兔与亚成年兔。本研究从四川省某规模化兔场送检病死兔中分离鉴定出2株RHDV2毒株,构建系统进化树,分析分离毒株发生的重组事件和氨基酸突变热点。并根据所获得毒株VP60序列建立RHDV2 SYBR Green I RT-q PCR方法,通过RT-q PCR方法对比不同日龄家兔在分别感染RHDV2和RHDV后的排毒动态及内脏病毒载量的差异。1.两株RHDV2毒株分离鉴定及遗传进化分析从四川省某规模化兔场病死兔中检测到RHDV2,设计引物分段扩增RHDV2全基因序列,连接p MD19-T（simple）载体并测序,并经过NCBI比对证明两株分离株均为RHDV2,将分离株分别命名为SCCN03、RHDV2/C/2021。本研究分离株SCCN03和RHDV2/C/2021分别与德国株Bremerhaven-17和中国株SC2020/0401一致性最高,分别为99.21%、99.54%。将两分离株与52株兔病毒属参考株绘制全基因、主要结构蛋白VP60、毒力蛋白p16的系统发育进化树.结果显示,本研究的分离株SCCN03、RHDV2/C/2021在全基因进化树上与欧洲株的亲缘关系最接近;在主要结构蛋白VP60进化树中,本研究两分离株之间亲缘关系最近;在毒力蛋白p16进化树上,分离株SCCN03与欧洲株的亲缘关系更近,而RHDV2/C/2021则与中国株SC2020/0401的亲缘关系更近。分析分离株氨基酸序列,它们的氨基酸序列突变热点主要集中在p16蛋白和VP10蛋白。RHDV2全基因重组分析结果表明,分离株SCCN03、RHDV2/C/2021发生了相同的重组事件,它们的重组断点99%置信区间位于5148～5674 nt,它们的主要亲本为2007年德国RHDVa分离株Erfurt。2.RHDV2 SYBR GreenⅠRT-q PCR检测方法的建立根据本研究分离株SCCN03的VP60基因序列设计1对引物,以阳性质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立RHDV2 SYBR Green I RT-q PCR检测方法,并优化反应体系,绘制RHDV2 RT-q PCR标准曲线,进行特异性试验、重复性试验和灵敏性试验。结果显示,本研究建立的RHDV2检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好。该方法可检测重组质粒p MD19-T-VP60的最低拷贝数为2.67copies/μL,且特异性好。以阳性质粒为模板进行扩增得到的Ct值组内变异系数均小于1%。用本研究建立的RHDV2 SYBR Green I RT-q PCR方法与6种国内外RHDV2 SYBRⅠRT-q PCR方法分别检测23份临床样品,结果表明本研究所建立的方法与国内外建立的RT-q PCR方法临床样品检测结果一致,阳性样品检出率为100%,可准确适用于RHDV2诊断。3.RHDV2/RHDV感染家兔试验为探究RHDV2/RHDV感染家兔致病性差异,对30日龄、90日龄、180日龄家兔分别进行RHDV2和RHDV攻毒试验,对比家兔在感染RHDV2和RHDV后通过唾液、粪便的排毒动态,并通过相对定量方法检测不同日龄家兔体内的病毒载量分布情况。RHDV2攻毒试验表明,RHDV2对所有日龄家兔均有100%致死率,其中幼兔感染RHDV2病程更短。攻毒后所有家兔血液病毒拷贝数在死亡前均呈上升趋势,在死亡时病毒拷贝数最高;所有家兔在攻毒后6 h时粪便和唾液种病毒拷贝数达到动态平衡,此后粪便、唾液中持续带毒。病理切片结果表明RHDV2的靶器官为肝脏;其他内脏RHDV2病毒载量与家兔日龄有关:幼兔的心脏病毒载量比其他两组要高且病理损伤更严重,成年兔组脾脏和肺脏病毒载量比其他两组要高且病理损伤更严重,肾脏未见发生病变。RHDV攻毒试验表明,RHDV对亚成年兔和成年兔有100%致死率,但对幼兔致死率为0。成年兔感染RHDV后的24 h内均出现死亡。攻毒后亚成年兔、成年兔血液病毒拷贝数在死亡前均上升,死亡时达到最高,同时亚成年兔、成年兔粪便和唾液的病毒拷贝数均是先上升后趋于平稳;幼兔在攻毒6 h后,粪便持续带毒,但该组家兔血液、唾液中病毒拷贝数变化趋势为先上升在下降,在72 h处死时,在幼兔唾液几乎检测不到RHDV。结合病理切片结果表明RHDV的靶器官为肝脏,对肝脏的损伤也最严重;对比不同日龄各组家兔其他内脏RHDV载量,结果发现成年兔的脾脏、肺脏组织病毒载量也高于其他两组家兔,病理损伤也更严重;所有家兔心脏均未发生病变。