目的：　　CADASIL作为最常见的遗传性脑小血管病是人类NOTCH3基因突变导致的，但其致病机制仍然不够清楚。早期的文献大多认为CADASIL的NOTCH3突变主要是NOTCH3跨膜受体胞外域的半胱氨酸数目发生改变，造成胞外结构域的错误折叠、蛋白聚集及清除障碍。近年来随着非半胱氨酸NOTCH3基因错义突变的CADASIL综合征的陆续个案报道，CADASIL发病的分子机制的研究再度引起国际社会的关注。本文首先系统报道了一例罕见的非半管氨酸型NOTCH3错义突变导致的CADASIL，通过详细收集本例脑小血管病的发病特点、临床表型、影像特征及家系调查，分析判断其是否符合典型CADASIL临床影像综合征;先证者基因检查显示:属于一种特殊的NOTCH3杂合突变c.218G＞C;p.(Gly73Ala)，目前为止，国际上尚未见有报道的一个NOTCH3基因突变位点，在ESP6500、千人基因组数据库和dbSNP里均未见报道，经初步生物信息学分析(PolyPhen-2)显示可能致病。其次，本文通过深入的家系调查，运用基本的遗传共分离法则对此种突变的致病性进行家系内验证。第三，这种非半胱氨酸数目变化型的NOTCH3的错义突变，其导致CADASIL发病的病理机制不清，针对本例Notch3错义突变位点，我们设计了系列分子生物学实验，探讨非半胱氨酸型的NOTCH3突变的分子及细胞生物学病理特性，分析其临床导致CADASIL发病的可能分子机制。　　方法：　　一.3年前，本科室收治了一例年轻起病的脑小血管病患者。患者无明确脑卒中危险因素，青年时期有长期的偏头痛发作史，先后有4次腔隙梗死发病。住院后进行脑小血管病常见危险因素的筛查，脑动脉粥样硬化的评估，相应的诊断和鉴别诊断，发现患者具有遗传性脑小血管病的倾向，进行了NOTCH3全外显子基因筛查，结果发现属于特殊Notch3的杂合突变，生物信息学分析(PolyPhen-2)显示可能具有致病性。给予抗血小板、他汀类药物及改善循环等治疗观察效果。　　二.对先证者一家进行了3年多的追踪随访，逐渐获得其家系中其他成员的健康情况和已经发病成员的就诊资料。将家系中患病成员的临床、影像和基因检测的资料进行整理、排列、对比和总结，发现符合常染色体显性遗传特点，确定了先证者符合典型CADASIL综合征。　　三、对此种特殊的NOTCH3错义突变的致病性进行家系内验证，采用家系内共分离的遗传法则:1.对先证者的同胞姐姐、弟弟和妹妹进行了临床、实验室及影像学资料系统收集，完成诊断及鉴别诊断，确定姐姐及弟弟都符合CADASIL临床和影像患者，妹妹是健康成人。2.Sanger测序法分别给予先证者的同胞姐姐及妹妹进行此同一NOTCH3突变位点的基因验证，先证者的弟弟不同意行基因检测，对患病的姐姐和健康的妹妹基因测定结果进行分析，判断此种特殊的基因突变与CADASIL发病在家系成员中是否存在共分离现象。　　四.为探寻此种非半胱氨酸数目变化型的Notch3突变的CADASIL的致病性，针对此种NOTCH3的突变位点c.218G＞C;p.(Gly73Ala)，设计了相应的的分子生物学实验，具体方法:　　1.细胞培养　　尽管CADASIL的病理损害主要是位于中小动脉平滑肌细胞，文献提示32体外培养的人主动脉平滑肌细胞可以表达突变型和野生型NOTCH3蛋白，但是转染后死亡率很高，多数不能存活超过2天，因而我们选择美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)的人胚肾细胞（贴壁生长的上皮细胞），细胞系:HEK293、HEK293T，常规保存;　　将于-196℃液氮罐或-150℃冰箱保存的HEK293、HEK293T细胞进行细胞复苏、培养、传代（贴壁细胞）和计数，当细胞处于指数增长期并且密度较大时，进行细胞冻存。　　2.质粒的扩增提取　　质粒:①NOTCH3胞外段表达质粒NOTCH3-bio-His:Addgene Catalog:53354②NOTCH3胞外段表达质粒NOTCH3-bio-His mutant type(NOTCH3c.218G＞C p.Gly73Ala)③NOTCH3胞内段表达质粒NICD:Addgene Catalog:40640　　在超净工作台内用无菌EP管操作，将购得的粗提质粒和20ul E.ColiDH5α感受态细菌进行转化，培养基内进行细菌培养，采用去内毒素质粒提取试剂盒(Omega bio-tek，D6950-02)提取质粒，测定质粒纯度及浓度，外送测序，-20℃低温保存。　　结果：　　一.先证者临床、影像、基因测定结果及家族情况　　1.先证者临床表现符合典型的CADASIL:28岁时开始频繁偏头痛发作。39岁时首次腔隙梗死发病，之后19年里反复4次小卒中发病。首诊时的表现:反应迟钝、语言流畅性差、执行功能下降、独自行走步态不利落、焦虑抑郁的情感障碍，MMSE评分22.糖耐量异常、轻度血压增高。2年多的追踪随访，给予患者规范的脑卒中预防措施，病情仍日缓慢持续进展，2年后(2017-07)第5次腔隙梗死，临床表现:脑功能障碍全面性进展:智能障碍明显加重MMSE评分17、语言表达不利，二便、步态障碍，不能生活自理。　　2.先证者头颅MRI结果符合典型的CADASIL影像异常（见图1-1至1-4）:(1)双侧多发陈旧腔隙梗塞灶，以基底节、半卵圆中心和桥脑为主;左顶叶皮质下可见新发小梗塞灶;(2)双侧对称分布的白质疏松，双侧颞叶内侧海马区、双侧侧脑室旁、侧脑室前角、后角以及下角周围、双侧外囊、额顶叶皮质下深部、半卵圆中心多发融合成片的T2及Flair高信号，双侧颞极未见受累。(3)基底节区、颞叶可见增多的血管周围间隙，(4)头颅MRA显示:轻度动脉粥样硬化。(5)2年后头颅MRI复查显示梗塞灶明显增多，多数为静默型梗塞，对称性白质损害严重(6)2年后头颅MRA与首诊时比较显示部分好转。　　二.家系成员的临床表现、影像学改变、基因检查及共分离现象　　先证者姐姐:55岁起病，先后3次腔隙梗死发病，无脑血管病危险因素，符合典型CADASIL临床表型及典型CADASIL的磁共振改变，Sanger测序显示NOTCH3基因杂合突变:NOTCH3c.218G＞C p.(Gly73Ala)，与先证者基因突变一致;　　先证者的弟弟:53岁起病，反复2次腔隙梗死发病，无常见脑血管病的危险因素，符合典型CADASIL临床表现及典型CADASIL磁共振改变，不同意行基因检测;　　先证者的妹妹:56岁，无临床症状，轻型糖尿病史2年，头颅MRI未见异常;Sanger测序结果:NOTCH3基因c.218G＞C位点无突变。　　综合以上家系调查结果可以获知:在此家系内存在CADASIL临床影像综合征与NOTCH3基因c.218G＞C位点杂合突变的共分离现象，支持此种首次发现的特异NOTCH3突变位点具有致病性。　　结论：　　先证者从起病特点、临床表型、影像改变及家系调查显示符合常染色体显性遗传的典型CADASIL综合征，全外显子基因检测显示国际上首次发现的NOTCH3基因杂合突变，c.218G＞C;p.(Gly73Ala)（甘氨酸替代丙氨酸），属于罕见的非半管氨酸型的错义突变，经初步生物信息学分析（PolyPhen-2）显示可能致病;家系内成员临床、影像与基因验证资料综合分析显示:此NOTCH3杂合突变与CADASIL综合征之间存在遗传共分离法则，强烈支持此突变位点具有致病性。　　高血压、糖尿病、高龄等其他危险因素，共病、吸烟等生活方式的不同可以对CADASIL的表型有一定的影响，CADASIL与散发性脑小血管病的鉴别主要靠相对早发、不能匹配的脑动脉粥样硬化的危险因素、家族史、系统规范的脑卒中的预防无效，影像学改变、家系成员筛查及追踪随访发现持续进展的临床静默型腔隙性脑梗塞及白质疏松，有倾向者早期行基因检测。　　此家系的这种非半胱氨酸型NOTCH3基因突变(c.218G＞C;p.G73A)，分泌的异常蛋白亚细胞结构定位在细胞的核周细胞质内。其生物学特性为:1.细胞质内突变型Notch3的分泌蛋白表达比野生型明显增多，并且产生更多颗粒状蛋白异常聚集颗粒,提示突变型有分泌蛋白的过度表达和细胞内异常积聚体增多或潴留的病理特性;2.细胞内核周围过度表达的蛋白或异常聚集体降解速率减慢;3.过度表达潴留在核周细胞质内的蛋白及其异常积聚体不影响经典的Notch信号通道的HES1基因。由此推测G73A非半胱氨酸型NOTCH3错义突变的分子病理机制可能是细胞内过度表达的异常膜蛋白或者分泌蛋白产生错误折叠而聚集，此细胞质内异常集聚体不能传递正常的NOTCH信号到细胞核内指导转录，过表达的异常蛋白降解速率减慢、细胞质内潴留，可能会增加内质网的应激、危害内质网等细胞器的生理功能，最终抑制细胞的增殖和活性，甚至导致细胞死亡。分子及细胞生物学特性的初步探讨支持这种非半胱氨酸型Notch3错义突变存在CADASIL致病性，有必要通过进一步的分子生物学实验探求其深入的分子病理机制。