环状RNA在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠中的表达及相关生物信息学分析

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目的:肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是一种慢性、进行性、致死性的肺部疾病,是多种疾病的终末期。特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是其中的特殊类型之一。目前其病因与发病机制不明,尚且没有有效的治疗方法。环状RNA(circular RNA,circRNA)是多种生物学过程的关键调控因子。目前circRNA在肺纤维化中的作用及机制尚不清楚。本研究旨在通过微阵列芯片技术,探讨circRNA在博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导的肺纤维化模型小鼠中差异表达,筛选在肺纤维化过程中可能起作用的的circRNA及可能的机制,为circRNA在肺纤维化中的研究提供理论基础。方法:1.将C57BL/6雄性小鼠,随机分为空白组与实验组。实验组小鼠通过气管滴入50μl 3%的博莱霉素稀释液建立肺纤维化小鼠模型,对照组给与生理盐水50μl,记为第0天。常规饲养,于第21天过量麻醉处死,收集左右肺叶组织用于制作组织病理切片,HE染色,Masson染色,Western Blot以及PCR验证。2.高通量芯片微阵列技术检测BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中差异表达的circRNA。分析差异circRNA的染色体位置分布。3.对差异circRNA的亲本基因进行GO(Gene Ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析预测。4.随机筛选出显著差异表达的circ.15941、circ.22225、mmucirc0001439、mmucirc0008785、circ.11013,并通过qRT-PCR验证其在BLM诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织中的表达水平。5.利用miRDB、Targetscan、miRTarbase等在线文库预测差异circRNA可能靶向吸附的前五个miRNA,再预测miRNA可能作用的靶标mRNA,利用cytoscope构建筛选并验证的表达差异的4个circRNA的ceRNA网络。利用GOplot R语言包分析ce-网络中差异mRNA的GO与KEGG富集条目,预测筛选可能的下游分子。结果:1.H&E染色结果显示:与对照组相比,BLM组小鼠肺组织内见肺泡的正常结构被破坏,肺泡壁和肺泡间隔显著增厚,肺泡腔变窄,炎性细胞积聚,并有大量成纤维细胞灶形成。Masson染色结果显示:相比于对照组,BLM组可见蓝染的胶原蛋白的大片沉积。Westrn Blot检测α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)与collagen I表达,可见BLM组显著高于对照组。说明肺纤维化模型成功建立。2.芯片微阵列结果分析显示相比于正常组,在BLM诱导的肺纤维化模型小鼠肺组织中,共筛选1007个circRNA差异表达,其中553个表达上调,454个表达下调。3.qRT-PCR验证circ.15941、circ.22225、mmucirc0001439在小鼠肺纤维化组织中高表达,mmucirc0008785低表达,与芯片结果一致。而芯片结果中表达上调的circ.11013表达水平未表现出明显差异。4.通过对差异表达的circRNA的亲本基因进行GO与KEGG富集。GO功能预测发现这些差异表达的基因主要与细胞外基质结构成分、肌浆网对钙离子释放的调控作用、胶原蛋白、凋亡信号通路、、细胞成分组织的调控、成纤维细胞迁移、蛋白磷酸化、蛋白质修饰过程等相关。KEGG信号通路结果显示小鼠肺纤维化中差异表达的circRNA主要与ECM-受体相互作用、MAPK信号通路、钙信号通路、PI3K-AKT信号通路、趋化因子信号通路、粘着斑、cAMP信号通路、Rap1信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路等相关。5.构建差异circRNA的ceRNA调控网络图。预测COL1A1、COL24A1、THBS4、TNC是差异circRNA可能的下游分子。结论:1.通过基因芯片微阵列技术识别博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中差异表达的circRNA,筛选出包括553个表达上调,454个表达下调的差异circRNA。2.对差异circRNA涉及的GO与KEGG富集分析,许多靶基因参与ECM-受体相互作用、PI3K-AKT等通路。提示这些差异表达的circRNA可能通过调节肺纤维化的多个过程来参与肺纤维化的发生发展。3.验证了筛选的circ.15941、circ.22225、mmucirc0001439、mmucirc0008785的表达,并建立相关circRNA的ceRNA调控网络,提示其本身以及参与调控的途径均可能成为肺纤维化干预治疗的新靶点。
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