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骨缺损的修复和重建是骨科临床面临的问题之一。自体骨是骨移植的金标准,但其来源有限且易引发供区并发症;同种异体骨和异种骨也可用于治疗骨缺损,但存在免疫排斥反应和病毒传播等潜在危险。利用组织工程技术将成骨性种子细胞与多孔支架材料复合后体外构建组织工程骨为骨缺损的临床治疗提供了新途径。但是,传统的静态细胞接种和培养方法存在细胞接种率低和分布均匀性差、支架内气体交换及营养供应不足等缺陷,降低了组织工程骨的成骨活性。本研究利用自行设计的灌注式生物反应器进行成骨细胞的灌注性三维动态接种和培养,以提高细胞的接种率和分布均匀性,促进支架内细胞的均匀增殖,增强组织工程骨的成骨活性和对节段性骨缺损的修复效果。1.成骨细胞在四种多孔支架材料内的灌注性三维动态接种研究目的:检验自行设计的灌注式生物反应器用于成骨细胞灌注接种的可行性,对比四种支架材料的细胞接种效果,筛选较优的支架材料。方法:选取异体松质骨粒、多孔磷酸三钙(β-TCP)、明胶海绵、胶原蛋白海绵四种支架材料作为载体,使用自行设计的生物反应器进行人胚胎成骨细胞的灌注接种,以静态接种方法为对照,通过细胞活力、活细胞接种率检测及组织学观察和计量,比较两种接种方法和四种支架材料对细胞接种效果的影响。结果:β-TCP和明胶海绵:灌注接种优于静态接种(P<0.05);松质骨粒:两接种组间无统计学差异;胶原蛋白海绵:灌注接种组的细胞活力、活细胞接种率和细胞计数均低于静态接种组(P<0.05),细胞分布均匀性则无显著差异。灌注接种时,β-TCP、明胶海绵的接种效果优于松质骨粒和胶原蛋白海绵,静态接种时,胶原蛋白海绵的细胞接种率和细胞计数最高。结论本研究自行设计的灌注式生物反应器提高了β-TCP和明胶海绵支架内成骨细胞的接种效率和分布均匀性。松质骨粒和胶原蛋白海绵不适于灌注接种方法,但胶原蛋白海绵适于静态接种方法。2.成骨细胞在多孔β-TCP支架内灌注性接种和培养的优化研究目的:探讨自行设计的灌注式生物反应器用于成骨细胞灌注性接种和培养的可行性,对比不同条件对细胞接种和培养效果的影响,筛选较优的细胞接种和培养条件。方法:以多孔β-TCP支架为载体,采用自行设计的灌注式生物反应器进行人胚胎成骨细胞的灌注接种和短期灌注培养,以静态接种方法为对照,比较细胞接种时间、细胞悬液密度、灌注接种及灌注培养速率的变化对活细胞接种率和细胞活力的影响。结果:灌注接种12h接种率显著高于8h和4h(P<0.05),但与24h间无统计学差异;灌注接种细胞悬液密度为2×10~5/mL时接种率显著高于1×10~5/mL(P<0.05),但与5×10~5/mL相比无统计学意义;灌注速率为1mL/min时灌注接种率最高。灌注培养24h内、灌注速率0.5mL/min～2mL/min间细胞活力无显著变化,但至4mL/min时细胞活力显著下降(P<0.05);24h至4d内灌注速率2mL/min时细胞活力最高。结论:细胞接种时间、细胞悬液密度、灌注接种和灌注培养速率等因素均影响细胞接种和培养效果;在本研究实验条件下,细胞灌注性接种和培养的最优条件为:接种时间12h～24h,细胞悬液密度2×10~5/mL～5×10~5/mL,灌注接种速率1mL/min,灌注培养速率0.5mL/min～2mL/min(24h内)和2mL/min(24h～4d)。3.利用灌注性细胞接种/培养系统体外构建组织工程骨目的:利用灌注性细胞接种和培养系统体外构建组织工程骨,以静态接种和静态培养(SSSC)以及静态接种和灌注培养(SSPC)为对照,对比三种方法的构建效果。方法:以多孔β-TCP支架为载体,采用自行设计的生物反应器进行人胚胎成骨细胞的灌注接种和灌注培养(PSPC),以SSSC法和SSPC法为对照,通过葡萄糖日耗量、细胞活力检测、扫描电镜(SEM)以及硬组织切片观察和组织形态学计量,比较三种方法的细胞增殖和分布情况。结果:三组的葡萄糖日耗量均随培养时间的延长而增加,SSPC组和PSPC组的葡萄糖日耗量高于SSSC组(P<0.05),培养6d内PSPC组的葡萄糖日耗量高于SSPC组(P<0.05),培养8d时两组的葡萄糖日耗量接近一致。SSPC组和PSPC组细胞活力无显著差异,但均高于SSSC组细胞活力(P<0.05)。SEM及组织学观察显示SSSC组细胞仅分布在支架周缘而SSPC组和PSPC组细胞在支架内部及周边均有分布且两组的细胞占孔率均高于SSSC组(P<0.05)。结论:PSPC法体外构建组织工程骨的效果优于SSSC法;培养8d后SSPC法和PSPC法的构建效果相似,但PSPC法可显著促进培养初期细胞增殖从而加快组织构建速度,随着支架载体体积和孔隙空间的增加这一优势可能更加明显。4.灌注法结合可控微结构β-TCP支架体外构建大体积组织工程骨目的:探讨采用灌注培养方法和可控微结构β-TCP支架体外构建大体积组织工程骨的构建效果以及支架微结构在其中的作用。方法:以快速成形(RP)技术制备的大体积可控微结构β-TCP支架为载体,采用自行设计的灌注式生物反应器进行人胚胎成骨细胞的灌注性三维培养,以静态培养方法为对照,通过葡萄糖日消耗量、细胞活力检测、组织学观察和计量、SEM观察及X射线能谱(EDX)分析,比较两种培养方法对支架内细胞增殖和分布的影响。结果:葡萄糖日耗量和细胞活力均随培养时间延长而升高(P<0.05),灌注培养组的葡萄糖日耗量和细胞活力显著高于静态培养组(P<0.05)。组织学及SEM观察显示静态培养条件下细胞仅在支架边缘存活而灌注培养条件下细胞在支架内部和边缘均能正常生长,细胞数量明显多于静态培养组;灌注培养支架内形成了以正交管道结构为模板的新生三维组织。EDX分析证实胞外类球体基质为磷酸钙结节。结论:灌注培养方法结合可控微结构β-TCP支架促进大体积支架内细胞均匀扩增和成骨分化;可控正交管道结构利于支架内形成均匀一致的营养供应和流体应力刺激环境;可控微结构可能影响新生组织的形态和分布。5.灌注法构建组织工程骨修复兔桡骨节段性缺损研究目的:探讨灌注性细胞接种和培养方法体外构建组织工程骨以及修复兔桡骨节段性缺损的可行性和效果。方法:以RP技术制备的可控微结构β-TCP支架为载体,采用自行设计的生物反应器进行兔成骨细胞的灌注接种和灌注培养(PSPC),以静态接种和静态培养(SSSC)以及静态接种和灌注培养(SSPC)方法为对照,通过葡萄糖日耗量、细胞活力检测和组织学观察,对比三种方法的细胞增殖和分布情况;将组织工程骨植入兔桡骨节段性骨缺损,以缺损旷置、自体骨和单纯β-TCP支架为对照,通过影像学和组织学检查比较骨缺损的修复效果。结果:PSPC组的葡萄糖日耗量和细胞活力高于SSPC和SSSC组(P<0.05),SSSC组细胞仅在支架边缘分布而PSPC组和SSPC组细胞在支架内部和边缘均有分布,PSPC组的细胞占孔率高于SSPC和SSSC组(P<0.05)。植入兔桡骨缺损12周后自体骨组6例全部愈合(6/6),SSPC组有2例愈合(2/6),PSPC组有4例愈合(4/6),其余各组缺损均未愈合。PSPC组的新骨生成量高于SSPC组、SSPC组和单纯β-TCP组(P<0.05)。β-TCP残余量与SSPC组相比无显著性差异但低于单纯β-TCP和SSSC组(P<0.05)。结论:PSPC法可促进支架内细胞增殖和均匀分布,构建的组织工程骨可修复兔桡骨节段性缺损,修复效果优于SSSC法和SSPC法但仍低于自体骨。RP支架的降解性有待改进。体内血管化和营养供应障碍可能导致支架内部分细胞死亡从而减弱了组织工程骨的修复效果。综上所述,以上研究结果说明,本研究自行设计的灌注式生物反应器可用于多孔支架材料上的成骨细胞灌注性接种和培养;与传统的静态细胞接种和培养方法以及采用静态接种的灌注培养方法相比,灌注性细胞接种和培养系统显著提高了支架内接种细胞的数量和分布均匀性,增强了支架内部营养物质的传输和气体交换,从而促进细胞在整个支架内均匀扩增,增强了组织工程骨的成骨活性和对兔桡骨节段性缺损的修复效果。灌注性细胞接种和培养方法优于显著增强了组织工程骨的成骨性能,构建的组织工程骨可修复兔桡骨节段性缺损。